诱导型启动子的获得及其应用制造技术

本发明专利技术公开了诱导型启动子的获得及其应用，属于基因工程领域。本发明专利技术通过正向—反向的选择方法筛选得到了受支链氨基酸或L‑甲硫氨酸诱导的启动子，该启动子与其上游基因组合成为一种传感器，该传感器能够显著提高目的蛋白的合成量，强度为野生型P

【技术实现步骤摘要】
诱导型启动子的获得及其应用
本专利技术涉及诱导型启动子的获得及其应用，属于基因工程领域。
技术介绍
谷氨酸棒状杆菌是一种不产芽孢的革兰氏阳性菌，因其在工业上被用于生产蛋白质氨基酸、非蛋白质氨基酸、有机酸、醇类和萜类等大宗化学品而被研究人员重视。谷氨酸棒状杆菌是一种被公认为安全的食品级生产菌，随着多株谷氨酸棒状杆菌的基因组完成测序，已获得它们的分子遗传背景信息。随后一些分子遗传工具被开发出来并应用到谷氨酸棒状杆菌的代谢工程改造中，以更有效地生产或者生产更多有价值的化学品。但是现有的遗传工具大多应用于静态代谢工程，而谷氨酸棒状杆菌的动态调控工具则很少。诱导型启动子作为动态调控工具的一部分，已被研究人员广泛地开发和应用于微生物的代谢工程。天然的诱导型启动子受灵敏度和调控范围的限制难以应用于代谢工程改造，需要对其进行改造以获得更适合的、可应用的诱导型启动子。谷氨酸棒状杆菌中的PbrnFE就具有这种特点。L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸这三种支链氨基酸和L-甲硫氨酸都属于人体必需氨基酸。谷氨酸棒状杆菌的转录调控因子Lrp能感受这四种氨基酸，Lrp属于转录激活蛋白，受它激活的下游靶基因为brnFE。当这四种氨基酸其中之一与Lrp结合后就会激活Lrp的转录正调控蛋白活性，促使Lrp结合在lrp和brnFE基因间区的PbrnFE启动子的-35区及其上游区域，并激活靶基因brnFE的转录，从而合成出支链氨基酸的外向转运蛋白BrnF和BrnE，将三种支链氨基酸向胞外转运。由于转录调控因子Lrp及其靶启动子PbrnFE对支链氨基酸和L-甲硫氨酸灵敏的感受性能，因此有研究将Lrp-PbrnFE系统开发成支链氨基酸和L-甲硫氨酸的特异性动态传感器，用来检测这四种氨基酸或者筛选、构建L-缬氨酸等的增产菌。其中的PbrnFE也可以看作是受支链氨基酸和L-甲硫氨酸诱导的诱导型启动子。但是，当采用该系统在谷氨酸棒杆菌中动态调节目标基因的表达时，由于天然的PbrnFE启动子强度较弱，使得目标基因的表达量不高，这限制了它的应用。因此，如何提高Lrp-PbrnFE传感器中PbrnFE启动子的强度，从而提高该系统的动态调控能力和PbrnFE启动子的诱导强度，仍然是一个重要的技术问题。(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种天然的非蛋白质氨基酸，具有促进胰岛素分泌，降低胰岛素抵抗，调节血脂异常，改善肝功能等生理作用，在治疗糖尿病及其并发症方面有良好的应用前景。目前4-HIL的主要制备方法是从葫芦巴种子中提取，但是产量很低，难以满足市场需求。α-酮戊二酸依赖性异亮氨酸双加氧酶(IDO)又叫做异亮氨酸羟化酶，能够催化L-异亮氨酸的C4位发生羟基化反应，生成4-HIL。利用基因工程技术将来源于芽孢杆菌的IDO编码基因ido导入到产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌中使其高效表达，利用工程菌表达出的IDO将菌体自身合成的L-异亮氨酸转变成4-HIL，这种4-HIL生产方法更为经济、有效。但是，由于该方法需要L-异亮氨酸、α-酮戊二酸、O2和草酰乙酸等多个底物及前体的供应，而静态代谢工程改造时这些底物和前体常常难以得到协调供应，致使4-HIL的合成效率不能有效提高。动态调控则能够克服这些不足，但是现有的动态调控工具表达强度太低，难以满足需求。因此，如何获得有效的动态调控工具、实现4-HIL合成的有效动态调控仍然是一个重要的技术问题。
技术实现思路
基于上述存在的问题，本专利技术通过正向—反向的选择方法(双选法)筛选得到一系列增强型启动子，在筛选过程中对于激活剂及其浓度范围、正选试剂浓度等都进行了优化，以保证筛选得到性能最好的启动子。本专利技术主要测试了将筛选得到的启动子与其上游蛋白Lrp组合之后，成为一种增加目的蛋白合成的传感器，将该传感器应用于4-HIL和α-酮戊二酸依赖性异亮氨酸双加氧酶(IDO)的合成，实际上该传感器还可以应用于其他任何可以受L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸这三种支链氨基酸和L-甲硫氨酸诱导或激活的相关产品的代谢工程改造中，且只要PbrnFE上存在Lrp结合序列，Lrp就能结合到PbrnFE上，调控PbrnFE行驶转录活性。本专利技术的第一个目的是提供一种启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1～6任一所示。本专利技术的第二个目的是提供一种受支链氨基酸和L-甲硫氨酸诱导的传感器，所述传感器由转录调控因子Lrp和启动子PbrnFE组成，所述启动子PbrnFE的核苷酸序列如SEQIDNO.1～6任一所示；其中，PbrnFE1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，PbrnFE5的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，PbrnFE7的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，PbrnFE9的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，PbrnFE13的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，PbrnFE5D的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述转录调控因子Lrp的编码基因lrp的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。在一种实施方式中，所述转录调控因子Lrp与启动子PbrnFE存在于同一体系内。在一种实施方式中，所述转录调控因子Lrp的编码基因存在于微生物基因组，或与启动子PbrnFE存在于同一载体上。在一种实施方式中，所述由转录调控因子Lrp和启动子PbrnFE组成的lrp-PbrnFE序列如SEQIDNO.9～14所示；其中，lrp-PbrnFE1核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，lrp-PbrnFE5核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，lrp-PbrnFE7核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，lrp-PbrnFE9核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，lrp-PbrnFE13核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，lrp-PbrnFE5D核苷酸序列如SEQIDNO.14所示。本专利技术的第三个目的是提供含有野生型启动子PbrnFE的出发质粒，所述质粒包括L-异亮氨酸传感器和筛选标记；所述L-异亮氨酸传感器是受L-异亮氨酸正调控的转录调控元件lrp-PbrnFE，由异亮氨酸转录调控因子Lrp的编码基因lrp及其下游启动子PbrnFE组成；所述筛选标记是四环素外排蛋白，其编码基因为tetA。在一种实施方式中，所述四环素外排蛋白编码基因为tetA基因如SEQIDNO.16所示。在一种实施方式中，所述L-异亮氨酸传感器和筛选标记之间含有RBS序列。在一种实施方式中，所述筛选标记包括但不限于编码四环素外排蛋白的tetA基因。在一种实施方式中，所述四环素外排蛋白基因tetA的序列为GenBank登录号AAB59735.1序列、SEQIDNO.16核苷酸序列。本专利技术的第四个目的是提供含有野生型启动子PbrnFE的出发质粒的构建方法，包括如下步骤：1)L-异亮氨酸传感器的构建：从谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种(C.glutamicumssp.lactofermentum)SN01(保藏编号为：CCTCCNO:M2014410，已公布于ApplMicrobiolBiot本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.诱导型启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6任一所示。/n

【技术特征摘要】
1.诱导型启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1～6任一所示。


2.一种受支链氨基酸或L-甲硫氨酸诱导的传感器，其特征在于，所述传感器由转录调控因子Lrp及其下游靶基因的启动子组成；所述编码转录调控因子Lrp的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；所述下游靶基因的启动子核苷酸序列如SEQIDNO.1～6任一所示。


3.根据权利要求2所述的传感器，其特征在于，所述转录调控因子Lrp及其下游靶启动子存在于同一体系内，所述同一体系为同一细胞。


4.根据权利要求3所述的传感器，其特征在于，所述转录调控因子Lrp的基因存在于宿主细胞基因组上，而其下游靶启动子存在于宿主细胞的载体上，或转录调控因子Lrp的基因及其下游靶启动子存在于同一载体上。


5.含有权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：史锋，谭书煜，李永富，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32