产松油醇的重组酿酒酵母及构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了产松油醇的重组酿酒酵母及构建方法及应用，产松油醇的重组酿酒酵母构建方法，包括如下步骤：利用同源重组的方法，向酿酒酵母ATCC：208352中导入截短的松油醇合酶编码基因ΔTs，得到重组菌1；向重组菌1中导入截短的3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1和异戊烯焦磷酸异构酶编码基因IDI1，得到重组菌2；实验证明，本发明专利技术的产松油醇的重组酿酒酵母发酵，使松油醇的产量高。本发明专利技术成功构建了产松油醇的重组酿酒酵母。为人工细胞合成松油醇奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
产松油醇的重组酿酒酵母及构建方法及应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种产松油醇的重组酿酒酵母及构建方法及应用。
技术介绍
松油醇是一种具有10个碳原子骨架的单萜醇类化合物，是许多植物精油的主要组成成分，其具有紫丁香味，其甲酸酯及乙酸酯可用于香精配制，用于高级溶剂及去臭剂，亦用于医药、农药、塑料、肥皂、油墨工业中，又是玻璃器皿上色彩的溶剂。目前其制备主要以植物提取或以松节油为原料，在硫酸加入少量平平加为乳化剂，常温下进行水合反应，使松节油中主要成分蒎烯生成水合萜二醇后，经脱水得粗松油醇，经分馏制得。合成生物学技术自其问世以来备受关注，其相对于基因工程涉及到大幅度的基因改造，注重代谢流量变化，是一个涉及到生物学、遗传学、化学、计算机科学以及工程学的交叉学科。许多萜类化合物具有很高的应用价值，而且有的在植物中含量少，不能很好地开发利用，用化合成的方法制备又繁琐复杂，以合成生物学技术，利用微生物平台合成植物源高附加值萜类化合物已成为该领域科学家们的研究热点，如利用酿酒酵母合成抗疟疾类药物青蒿素的前体青蒿酸；利用大肠杆菌合成抗癌药物紫杉醇前体紫杉二烯；利用酿酒酵母合成抗菌消炎类药物丹参酮的前体次丹参酮二烯等。然而，利用酿酒酵母为底盘合成单萜松油醇未见报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种产松油醇的重组酿酒酵母。本专利技术的第二个目的是提供第二种产松油醇的重组酿酒酵母。本专利技术的第三个目的是提供第三种产松油醇的重组酿酒酵母。本专利技术的第四个目的是提供第四种产松油醇的重组酿酒酵母。本专利技术的第五个目的是提供第五种产松油醇的重组酿酒酵母。本专利技术的第六个目的是提供上述产松油醇的重组酿酒酵母的构建方法。本专利技术的第七个目的是提供上述产松油醇的重组酿酒酵母在发酵制备松油醇的应用。本专利技术的技术方案概述如下：一种产松油醇的重组酿酒酵母构建方法，包括如下步骤：利用同源重组的方法，向酿酒酵母ATCC：208352中导入截短的松油醇合酶编码基因ΔTs，得到重组菌1；所述截短的松油醇合酶编码基因ΔTs的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。第二种产松油醇的重组酿酒酵母构建方法，包括如下步骤：利用同源重组的方法，向重组菌1中导入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1和异戊烯焦磷酸异构酶编码基因IDI1，得到重组菌2；所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述异戊烯焦磷酸异构酶编码基因IDI1的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。第三种产松油醇的重组酿酒酵母构建方法，包括如下步骤：利用同源重组的方法，向重组菌2中的ERG20位点导入突变的法呢基焦磷酸合酶编码基因MErg20，得到重组菌3；所述突变的法呢基焦磷酸合酶编码基因MErg20的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。第四种产松油醇的重组酿酒酵母构建方法，包括如下步骤：利用同源重组的方法，向重组菌3中导入突变的法呢基焦磷酸合酶与截短的松油醇合酶的融合蛋白编码基因ERG20FTs，得到重组菌4；所述编码基因ERG20FTs的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。第五种产松油醇的重组酿酒酵母构建方法，包括如下步骤：利用同源重组的方法，向重组菌4中导入鲨烯合酶编码基因ERG9，获得重组菌5；所述鲨烯合酶编码基因ERG9的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。上述各个方法构建的产松油醇的重组酿酒酵母。上述产松油醇的重组酿酒酵母在在生产松油醇中的应用。本专利技术的实验证明，本专利技术的产松油醇的重组酿酒酵母发酵，使松油醇的产量高。本专利技术成功构建了产松油醇的重组酿酒酵母。为人工细胞合成松油醇奠定了基础。附图说明图1为松油醇GC-MS分析结果。图1中的a为检测的气相色谱图。a中的A为W303-1a气质联用检测谱图；B为重组菌1气质联用检测谱图；C为松油醇标准品气质联用检测谱图；1为松油醇标准品色谱峰；2为重组菌1生产的产物色谱峰。图1中的b为重组菌1生产的产物质谱图，即a中峰2对应的质谱图。图1中的c为松油醇标准品的质谱图，即a中峰1对应的质谱图。图2为各重组酿酒酵母菌株的松油醇产量的对比。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeW303-1a，美国ATCC：208352)购买时间，2016.6网址：https://www.atcc.org/实施例1、各片段来源制备方法(1)本专利技术所用的基因原件△TS序列(截短的△TS，原本的TS来源于葡萄(Vitisvinifera))；MErg20序列(突变的ERG20，原本的ERG20来自于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、ERG20FTs序列(突变的ERG20与△TS的融合蛋白编码基因)。URA3序列，ADE2序列、TRP1序列，LEU2序列，HIS3序列均来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))，由公司全合成，并连接在大肠杆菌质粒pUC57上，保存在大肠杆菌中。所述△TS的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示、MErg20的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示、ERG20FTs(编码融合蛋白的基因的人工序列)的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示、URA3的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示、ADE2的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示、TRP1的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示、LEU2的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示、HIS3的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示。(2)本专利技术所用酿酒酵母内源片段，通过提取酿酒酵母基因组，以其为模板，通过PCR扩增得到。酿酒酵母基因组的提取方法为：将酿酒酵母(W303-1a)接种于液体YPD培养基中，30℃摇床过夜培养；吸取过夜培养的酿酒酵母到2mL离心管中，10000rpm转速下离心1min，弃上清液，收集底部菌体沉淀；向离心管中加入与菌体体积相等的石英砂，然后加入400μL的STES裂解液，400μL酚/氯仿/异戊醇；将上述混合物置于振荡器，振荡10min；向振荡结束的离心管中加入400μL的TE溶液，混合均匀，离心取上清液，将上清液转移到新的2mL离心管中；然后向收集的上清液中加入1/10体积的3MNaAc，2倍体积的无水乙醇，混合均匀后置于-20℃放置1h，10000rpm离心10min，可看见离心管底部有少量白色沉淀，即基因组DNA，除去上清液，用75％乙醇漂洗一次；在通风处，使离心管中残余的酒精充分挥发，然后加入100μL水，即完本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产松油醇的重组酿酒酵母构建方法，其特征是包括如下步骤：/n利用同源重组的方法，向酿酒酵母ATCC：208352中导入截短的松油醇合酶编码基因ΔTs，得到重组菌1；/n所述截短的松油醇合酶编码基因ΔTs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种产松油醇的重组酿酒酵母构建方法，其特征是包括如下步骤：
利用同源重组的方法，向酿酒酵母ATCC：208352中导入截短的松油醇合酶编码基因ΔTs，得到重组菌1；
所述截短的松油醇合酶编码基因ΔTs的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种产松油醇的重组酿酒酵母构建方法，其特征是包括如下步骤：
利用同源重组的方法，向重组菌1中导入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1和异戊烯焦磷酸异构酶编码基因IDI1，得到重组菌2；
所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；
所述异戊烯焦磷酸异构酶编码基因IDI1的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。


3.一种产松油醇的重组酿酒酵母构建方法，其特征是包括如下步骤：
利用同源重组的方法，向重组菌2中的ERG20位点导入突变的法呢基...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢文玉，张传波，南伟华，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12