一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法及其应用。该方法包括如下步骤：S1、将活化的绿藻细胞接种至无氮含糖培养基中并分成n份，然后分别加入浓度梯度的化学诱导剂进行诱导培养，依次得到诱导剂组绿藻细胞，同时以不加入化学诱导剂为对照，得到对照组绿藻细胞；S2、采用流式细胞仪分别测定诱导剂组绿藻细胞和对照组绿藻细胞内叶绿素的平均荧光强度；S3、根据诱导剂组和对照组绿藻细胞内叶绿素的平均荧光强度判断该化学诱导剂是否能提高绿藻细胞内产油量，并以此筛选出最佳诱导浓度。本发明专利技术方法可以筛选出能有效提高绿藻产油量的化学诱导剂，进而可将其用于培养绿藻细胞生产生物柴油原料油和/或食用型藻油。

【技术实现步骤摘要】
一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法及其应用
本专利技术属于工业生物
，特别涉及一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法及其应用。
技术介绍
微藻是一大类单细胞低等植物的总称，具有植物和微生物的双重特性，特殊品种能在缺氮、高碳氮比培养条件下能积累大量油脂，是藻基生物燃料、藻基食用油脂的优质原料，其生物量和油脂(总脂和脂肪酸)的高产发酵技术一直是本领域的研究热点。佐夫色绿藻(Chromochloriszofingiensis)是一种单细胞绿藻，生长速率快，能够在黑暗条件下利用有机碳源进行异养高细胞密度发酵，同时高碳氮比时在细胞内积累类胡萝卜素和脂类等多种高价值代谢产物，是目前微藻油脂生产的重要种质之一。研究表明，佐夫色绿藻在高光、高盐、氮磷营养元素限制等诱导条件下可以有效积累藻油，但相对于广泛采用的小球藻等绿藻种质，佐夫色绿藻油脂产量还比较低，生产成本还相对较高。如能筛选获得高效的化学诱导剂，显著提高佐夫色绿藻的油脂产量，对于微藻产油的生产技术进步、促进商业化开发利用具有非常重要的意义。诱导条件是决定佐夫色绿藻胞内油脂积累量的重要影响因素，在微藻合成油脂的代谢调控中具有积极作用。目前常见的促进油脂积累的化学诱导物主要有三大类，分别是中间代谢前体物、氧化还原诱导物以及代谢抑制剂等化学诱导物等。其中，后两者本质上都是诱导藻细胞内氧化水平的提高，进而通过活性氧自由基(ROS)信号介导的调控机制来诱导油脂的合成。通过快速筛选实验可以获得有助于油脂高效积累的化学诱导剂诱导条件，再结合特定设计的适宜微藻的诱导培养装置，可以进一步显著提高佐夫色绿藻胞内油脂积累量。此外，采用化学诱导物进行佐夫色绿藻细胞的生理代谢具有经济高效、简便快捷、易于操作和调控微藻细胞代谢的优势，目前在微藻培养积累高价值代谢产物方面具有重要的商业化应用前景。根据文献检索，能够提高微藻油脂产量的化学诱导物种类多，诱导效果差异大，如何快速检测评估其诱导效果是实现高效筛选化学诱导物的关键。传统的微藻油脂含量检测方法，主要有溶剂提取称重法和脂类荧光染色法等，涉及到样品处理和检测等多个步骤，所需要的检测时间较长，工作效率比较低，也无法实现快速、批量检测，在大规模批量筛选和评估化学诱导物时具有很大局限性。现有研究表明，微藻细胞在缺氮胁迫下大量积累油脂时，会伴随着叶绿体的自噬解体和叶绿素的降解转化，而通过检测微藻细胞的叶绿素含量就可以间接反映出微藻油脂含量。这是因为叶绿素是微藻细胞内的含氮化合物，在微藻细胞处于胞外完全缺氮前提下，微藻细胞会首先将叶绿素降解转化用于细胞内必需的氮素。这时，如果胞内氮源尤其是叶绿素的含量越高，就说明越少叶绿素被降解转化，这样会显著加剧微藻细胞内的缺氮水平，从而显著提高油脂积累量。简言之，在微藻胞外完全无氮条件下进行诱导胁迫培养，微藻细胞中叶绿素含量越高，其油脂积累量也越高，两者呈现出正相关性。目前微藻胞内油脂含量测定方法为有机溶剂提取称重法和荧光染料染色法等，而叶绿素含量测定主要采用传统的紫外可见分光法和液相色谱法等。这些测定方法存在费时费力，检测效率低等缺点。因此，建立一种简单、有效、快速的筛选方法，为佐夫色绿藻生产油脂的工艺开发利用提供创新技术支撑具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法。本专利技术的另一目的在于提供所述用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，包括如下步骤：S1、初筛诱导培养：将活化的绿藻细胞接种至无氮含糖培养基中并分成n份，然后分别加入浓度为C1，C2……Cn(按浓度梯度进行)的化学诱导剂进行诱导培养，依次得到诱导剂组绿藻细胞A1，A2……An，同时在相同条件下以不加入化学诱导剂为对照，得到对照组绿藻细胞；其中n≥2，且为整数；浓度C1>C2……>Cn；S2、MFI值测定：采用流式细胞仪分别测定步骤S1中得到的诱导剂组绿藻细胞A1，A2……An以及对照组绿藻细胞内叶绿素的平均荧光强度，依次得到诱导剂组绿藻细胞的平均荧光强度值MFI1、MFI2……MFIn，以及对照组绿藻细胞的平均荧光强度值MFI0；S3、初筛判断：①若MFI1≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C1时能够提高绿藻细胞内产油量，反之，若MFI1＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C1时不能提高绿藻细胞内产油量(即该化学诱导剂在浓度为C1时对绿藻细胞产油量无诱导刺激作用效果)；同理，若MFI2≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C2时能够提高绿藻细胞内产油量，若MFI2＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C2时不能提高绿藻细胞内产油量；以此类推，若MFIn≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cn时能够提高绿藻细胞内产油量，反之，若MFIn＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cn时不能提高绿藻细胞内产油量；和/或，②将MFI1、MFI2……MFIn进行排序，取最大值，命名为MFIx，并获得与MFIx相对应的化学诱导剂的浓度，命名为Cx；若MFIx≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cx时能够提高绿藻细胞内产油量，以该浓度为化学诱导剂的最佳诱导浓度；若MFIx＜MFI0，则说明该化学诱导剂对绿藻细胞产油量无诱导刺激作用效果(即该化学诱导剂不能用于提高绿藻细胞内产油量)。步骤S1中所述的绿藻为色绿藻、小球藻、栅藻、衣藻和盐藻中的至少一种；优选为佐夫色绿藻(Chromochloriszofingiensis)。步骤S1中所述的分成n份优选为平均分成n份。步骤S1中所述的活化为通过如下步骤实现：先将绿藻细胞接种到斜面固体培养基中进行培养，然后转接至液体培养基中进行循环往复振荡培养3～5天，得到活化的绿藻细胞；其中，所述的培养的条件均为：转速为50～500rpm，培养温度20～30℃(优选为26℃)，光照10～30μmolm-2s-1(优选为10μmolm-2s-1)，光暗周期为0:24(h)～24:0(h)，pH6.0～7.0(优选为6.5)。所述的液体培养基为Bristol、Basal、BG-11、BBM或Kuhl培养基；优选为改良的Bristol、Basal、BG-11、BBM或Kuhl培养基；更优选为含有如下组分：10000mg/L葡萄糖，75mg/LK2HPO4，5mg/LFeCl3，25mg/LNaCl，0.061mg/LH3BO3，750mg/LNaNO3，25mg/LMgSO4·7H2O，25mg/LCaCl2·2H2O，0.287mg/LZnSO4·7H2O，175mg/LKH2PO4，0.0025mg/LCuSO4·5H2O，0.169mg/LMnSO4·H2O，0.00124mg/L(NH4)6Mo7O24·7H2O。步骤S1中所述的无氮含糖培养基含有如下组分：10000mg/L葡萄糖，75mg/LK2HPO4，5mg/LFeCl3，25mg/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、初筛诱导培养：将活化的绿藻细胞接种至无氮含糖培养基中并分成n份，然后分别加入浓度为C

【技术特征摘要】
1.一种用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、初筛诱导培养：将活化的绿藻细胞接种至无氮含糖培养基中并分成n份，然后分别加入浓度为C1，C2……Cn的化学诱导剂进行诱导培养，依次得到诱导剂组绿藻细胞A1，A2……An，同时在相同条件下以不加入化学诱导剂为对照，得到对照组绿藻细胞；其中n≥2，且为整数；浓度C1>C2……>Cn；
S2、MFI值测定：采用流式细胞仪分别测定步骤S1中得到的诱导剂组绿藻细胞A1，A2……An以及对照组绿藻细胞内叶绿素的平均荧光强度，依次得到诱导剂组绿藻细胞的平均荧光强度值MFI1、MFI2……MFIn，以及对照组绿藻细胞的平均荧光强度值MFI0；
S3、初筛判断：
①若MFI1≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C1时能够提高绿藻细胞内产油量，反之，若MFI1＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C1时不能提高绿藻细胞内产油量；同理，若MFI2≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C2时能够提高绿藻细胞内产油量，若MFI2＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为C2时不能提高绿藻细胞内产油量；以此类推，若MFIn≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cn时能够提高绿藻细胞内产油量，反之，若MFIn＜MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cn时不能提高绿藻细胞内产油量；
和/或，
②将MFI1、MFI2……MFIn进行排序，取最大值，命名为MFIx，并获得与MFIx相对应的化学诱导剂的浓度，命名为Cx；若MFIx≥MFI0，则说明该化学诱导剂在浓度为Cx时能够提高绿藻细胞内产油量，以该浓度为化学诱导剂的最佳诱导浓度；若MFIx＜MFI0，则说明该化学诱导剂对绿藻细胞产油量无诱导刺激作用效果。


2.根据权利要求1所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，其特征在于，在步骤S3之后还包括复筛的步骤；具体如下：
(I)将活化的绿藻细胞接种至无氮含糖培养基中，然后以步骤S3中获得的化学诱导物的最佳诱导浓度作为化学诱导物的浓度，对绿藻细胞进行培养，同时以不加入化学诱导剂为对照，得到诱导剂组绿藻细胞和对照组绿藻细胞；
(II)培养结束后测定诱导剂组绿藻细胞的油脂的含量H1以及对照组绿藻细胞的油脂的含量H2，和/或测定诱导剂组绿藻细胞的油脂的产量Y1以及对照组绿藻细胞的油脂的产量Y2；
(II)若Y1>Y2和/或H1>H2，则确定该化学诱导剂为可用于提高绿藻细胞的产油量的化学诱导剂；
步骤(I)中所述的绿藻细胞的接种密度为2～3g/L；
步骤(I)中所述的诱导培养的条件为：转速50～500rpm，培养温度20～30℃，采用白光光源，光照300±30μmolm-2s-1，培养时间12天以上；
步骤(II)中所述的油脂的含量为通过测定绿藻细胞的总脂和/或脂肪酸含量获得；
步骤(II)中所述的油脂的产量为通过测定绿藻细胞的总脂和/或脂肪酸产量获得。


3.根据权利要求1所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，其特征在于：
步骤S1中所述的化学诱导剂为氧化类试剂，还原类试剂，醇类试剂，盐类试剂，代谢调控类试剂和有机酸类试剂中的至少一种；
步骤S1中所述的加入的化学诱导剂的终浓度为体积百分比0～0.1％；
步骤S2中所述的平均荧光强度值为采用流式细胞仪测定藻细胞在FL3通道的平均荧光强度值；其中，FL3通道的光谱范围为>670nm。


4.根据权利要求3所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，其特征在于：
所述的氧化类试剂的最高添加浓度为不高于64.5mg/L；
所述的还原类试剂的最高添加浓度为不高于6.61mg/L；
所述的醇类试剂的最高添加浓度为不高于体积百分比2％；
所述的盐类试剂的最高添加浓度为不高于12710mg/L；
所述的代谢调控类试剂的最高添加浓度为不高于1180mg/L；
所述的有机酸类试剂的最高添加浓度为不高于9600mg/L。


5.根据权利要求3所述的用于提高绿藻产油的化学诱导剂的筛选方法，其特征在于：
步骤S1中所述的化学诱导剂为2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐，过氧化氢，乙醇，丁基羟基苯甲醚，2,6-二叔丁基对甲酚，没食子酸丙酯、表没食子儿茶素没食子酸酯，三甲基甘氨酸，原钒酸钠，乙酰胆碱，二氯苯基二甲脲，草甘膦，莠去津，丙酮酸，柠檬酸，苹果酸，α-酮戊二酸，氯化镁和氯化钾中的一种以上；
所述的2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)在诱导培养体系中的终浓度为2.7～27.1mg/L；
所述的过氧化氢在诱导培养体系中的终浓度为32.3～64.5mg/L；
所述的乙醇在诱导培养体系中的终浓度为体积百分比1.0～2.0％；
所述的丁基羟基苯甲醚在诱导培养体系中的终浓度为0.54～5.41mg/L；
所述的2,6-二叔丁基对甲酚在诱导培养体系中的终浓度为0.66～6.61mg/L；
所述的没食子酸丙酯在诱导培养体系中的终浓度为0.085～0.849mg/L；
所述的表没食子儿茶素没食子酸酯在诱导培养体系中的终浓度为0.2～1.8mg/L；
所述的三甲基甘氨酸在诱导培养体系中的终浓度为590～118...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏东，陈俊辉，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44