以硝唑尼特和咪唑立宾为有效成分的猫杯状病毒抑制剂制造技术

本发明专利技术公开了一种以硝唑尼特与咪唑立宾为有效成分的猫杯状病毒抑制剂，其中硝唑尼特的作用浓度为1.529μmol/L～200μmol/L，在200μmol/L时，细胞活性大于90%。咪唑立宾的作用浓度为1.529μmol/L～200μmol/L，在200μmol/L时，且细胞活性大于90%。硝唑尼特与咪唑立宾对猫杯状病毒的抑制作用发生在病毒感染的复制阶段。0.2μmol/L～2.5μmol/L浓度的硝唑尼特与0.6μmol/L～20μmol/L浓度的咪唑立宾同时使用时，具有协同作用，其中当硝唑尼特0.3μmol/L～1.2μmol/L、咪唑立宾2.5μmol/L～10μmol/L时最为显著。

【技术实现步骤摘要】
以硝唑尼特和咪唑立宾为有效成分的猫杯状病毒抑制剂
本专利技术涉及医药领域，尤其涉及一种以硝唑尼特与咪唑立宾为有效成分的猫杯状病毒抑制剂。
技术介绍
猫杯状病毒(Felinecalicivirus，FCV)是杯状病毒科(Caliciviridae)的主要代表，其主要引起猫科动物的上呼吸道疾病。一些强毒株可引起全身性的疾病，主要体现于皮下水肿，多个器官（肝、脾、胰腺）的坏死和间质性肺炎。过去30年中，市场上已有可购买的猫杯状病毒商品化疫苗，但猫杯状病毒仍然在猫群中高度流行，并且目前市售的疫苗中没有一种可以保护猫免受所有猫杯状病毒毒株的侵害。就猫杯状病毒而言，研究人员已发现了多种药物在体外对其有抗病毒作用。但其中大部分都停留在单一化合物的抗病毒研究的水平上，这些化合物是否具有药物协同作用的效果还未知。因此，迫切需要开发一种能有效抗猫杯状病毒的药物，来抑制或控制猫杯状病毒的传播。硝唑尼特(Nitazoxanide,NTZ)，中文别名2-乙酰氧基-N-（5-硝基-2-噻唑基）苯甲酰胺，是一种广谱的抗原虫药物，如治疗隐孢子虫、贾第鞭毛虫、阿米巴原虫引起的腹泻。此外，它也被证明对多种RNA和DNA病毒有抗病毒作用。硝唑尼特是被美国食品药品监督管理局(USFoodandDrugAdministration,FDA)批准的口服药物之一，同时其也被发现对猫杯状病毒同科的诺如病毒(NorwalkViruses,NV)有抗病毒作用。咪唑立宾(Mizoribine,MZR)，中文别名1-[（2R,3R,4S,5R）-3,4-二羟基-5-（羟甲基）氧戊环-2-基]-5-羟基-1H-咪唑-4-羧酰胺，是一种咪唑核苷，由于其对淋巴细胞有抑制作用，因此在一些国家或地区已被用作免疫抑制剂，用于治疗肾移植、自身免疫性疾病和类固醇抵抗性肾病综合征。近些年发现，咪唑立宾对巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)、呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus,RSV)、严重急性呼吸综合征(SevereAcuteRespiratorySyndrome,SARS-CoV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)、口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus,FMDV)具有抗病毒作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前猫杯状病毒防治过程中存在的问题，而提供一种以硝唑尼特和咪唑立宾为有效成分的猫杯状病毒抑制剂。所述抑制剂能在体外有效抑制猫杯状病毒的复制，同时具有较低的细胞毒性，可显著降低猫杯状病毒的病毒滴度及其mRNA的表达水平。硝唑尼特和/或咪唑立宾在制备抗猫杯状病毒药物方面的应用。一种猫杯状病毒抑制剂，硝唑尼特和咪唑立宾的摩尔比为：0.2～2.5:0.6～20；所述的摩尔比为0.3～1.2:2.5～10。本专利技术的有益效果：1、本专利技术所述猫杯状病毒抑制剂，以硝唑尼特和咪唑立宾为基础，评估其对猫杯状病毒的抑制效果，该抑制剂能从体外有效的抑制猫杯状病毒的复制。所述的抑制作用发生在猫杯状病毒感染的复制阶段。更进一步，在病毒复制的任意时间，更确切地说，主要在复制阶段的前8h，硝唑尼特与咪唑立宾对病毒均具有抑制作用。加之，硝唑尼特与咪唑立宾成分清楚单一，这就为将硝唑尼特与咪唑立宾应用于猫杯状病毒的分子或细胞学研究，以及进行抗病毒药物的研究奠定了基础和提供了便利的条件。2、本专利技术所述猫杯状病毒抑制剂，基于硝唑尼特与咪唑立宾能够抑制猫杯状病毒的复制，提出其在制备抗猫杯状病毒药物中的应用，当硝唑尼特浓度高至200μmol/L时，依旧能够保证正常细胞活性率在90%以上，同时硝唑尼特浓度为20μmol/L时，相比于阴性对照组，处理后猫杯状病毒的mRNA表达水平下降约88%，猫杯状病毒的病毒滴度下降约25%。当咪唑立宾浓度高至200μmol/L时，依旧能够保证正常细胞活性率在90%以上，同时咪唑立宾浓度为20μmol/L时，相比于阴性对照组，处理后猫杯状病毒的mRNA表达水平下降约92%，猫杯状病毒的病毒滴度下降约24%。将其制备成猫杯状病毒药物，相比于常用的疫苗免疫，制备简单、使用方便、成本较低、作用周期较长。3、本专利技术所述猫杯状病毒抑制剂，基于硝唑尼特与咪唑立宾能够协同抑制猫杯状病毒的复制，提出其在制备抗猫杯状病毒药物中的应用。当硝唑尼特与咪唑立宾的药物浓度分别不高于2.5μmol/L和20μmol/L时，相比于阴性对照，两者合用具有抗猫杯状病毒的协同作用。当0.2μmol/L～2.5μmol/L的硝唑尼特与0.6μmol/L～20μmol/L的咪唑立宾同时使用时，两个药物显示出对猫杯状病毒抗病毒的协同作用，其中当硝唑尼特浓度范围为0.3μmol/L～1.2μmol/L、咪唑立宾浓度范围为2.5μmol/L～10μmol/L最为显著，这就为利用硝唑尼特与咪唑立宾相关药物来防治猫杯状病毒感染奠定了理论基础。附图说明图1是不同浓度的硝唑尼特对F81细胞的毒性结果图；图2是不同浓度的咪唑立宾对F81细胞的毒性结果图；图3是不同浓度的硝唑尼特对FCV抑制作用的间接免疫荧光OD分析图；图4是不同浓度的硝唑尼特对FCV病毒滴度的影响差异图；图5是不同浓度的硝唑尼特对FCVmRNA表达水平的影响差异图；图6是不同浓度的咪唑立宾对FCV抑制作用的间接免疫荧光OD分析图；图7是不同浓度的硝唑尼特对FCV的抑制浓度分析图；图8是不同浓度的咪唑立宾对FCV病毒滴度的影响差异图；图9是不同浓度的咪唑立宾对FCVmRNA表达水平的影响差异图；图10是不同浓度的咪唑立宾对FCV的抑制浓度分析图；图11是不同时间添加硝唑尼特对FCV病毒滴度的影响差异图；图12是不同时间添加硝唑尼特对FCVmRNA表达水平的影响差异图；图13是不同时间添加咪唑立宾对FCV病毒滴度的影响差异图；图14是不同时间添加咪唑立宾对FCVmRNA表达水平的影响差异图；图15是不同浓度的硝唑尼特对FCV协同抑制作用的分析图；图16是不同浓度的硝唑尼特与咪唑立宾对FCV协同抑制作用的分析图。具体实施方式实验材料1、药物来源：咪唑立宾（Mizoribine,MZR）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，产品编号为M129842。硝唑尼特（Nitazoxanide,NTZ）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，产品编号为N159057。2、生化试剂：MEM、PBS、FBS购自Gibco。DMSO购自Sigma。CCK8购自白鲨生物。SimplyP总RNA提取试剂盒购自Bioer。RNA反转录试剂、SYBR®Prime-ScriptTMRT-PCRKit购自宝生生物。抗猫杯状病毒IgG(一抗)购自VMRD，二抗FITC标记兔抗猫IgG购自博奥森。3、RT-qPCR引物序列如表1所示。实施例1硝唑尼特与咪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.硝唑尼特和/或咪唑立宾在制备抗猫杯状病毒药物方面的应用。/n

【技术特征摘要】
1.硝唑尼特和/或咪唑立宾在制备抗猫杯状病毒药物方面的应用。


2.一种猫杯状病毒抑制剂，其特征在于：硝唑尼特和咪唑立宾的摩尔比为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王开，崔占鼎，张双，李登亮，裴志花，郭衍冰，赵艳丽，董浩，黄海龙，张茜，陈晓学莹，腾月，赵石卉，邵将，胡桂学，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22