MicroRNA微纳米球的制备方法及其在脊髓损伤修复中的应用技术

本发明专利技术公开了一种MicroRNA微纳米球的制备方法，包括：采用复乳法制备聚乳酸‑羟基乙酸共聚物微纳米球溶液；将聚醚酰亚胺水溶液加入到聚乳酸‑羟基乙酸共聚物微纳米球溶液充分振荡混匀形成聚醚酰亚胺修饰的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物微纳米球复合物溶液；将不同的MicroRNAs负载到微球上，形成MicroRNAs微球复合物。本发明专利技术通过生物高分子聚乳酸‑羟基乙酸共聚物微纳米球结合调控多种MicroRNA表达，脊髓损伤后形成有利于再生的局部微环境，促进脊髓损伤后修复。

【技术实现步骤摘要】
MicroRNA微纳米球的制备方法及其在脊髓损伤修复中的应用
本专利技术涉及一种MicroRNA微纳米球的制备方法及其在脊髓损伤修复中的应用，属于生物医学

技术介绍
脊髓损伤(spinalcordinjury)是一种严重的中枢神经系统性创伤，呈现高发生率、高死亡率、高致残率的特征，随着我国现代经济社会和交通建筑事业发展，发病率逐年上升，每年新增病例超过6万人，给患者以及社会带来沉重负担。脊髓损伤病理发展过程是一个多因素多步骤参与的综合网络调控过程，大致可分为两个阶段：第一阶段是脊髓的直接损伤，即突然压迫下感觉、运动和自主神经功能即刻丢失，其本质是脊髓灰质和灰质内微血管受损而引发；第二阶段主要来自脊髓白质受损，在损伤最初几分钟内出现血管和代谢障碍，几小时后信号分子离子通道改变导致神经递质变化以及脂质过氧化，数周后进一步发展出现炎症细胞级联反应以及神经细胞凋亡，最终由于脱髓鞘病变和胶质瘢痕形成导致白质纤维素损伤。microRNAs(miRNAs)是一类能够调控靶基因表达的小分子RNA，在脊髓损伤导致的继发性损伤和局部再生过程中都扮演着重要角色，近年来已经成为脊髓损伤后神经修复和再生的治疗性干预新靶点。目前，microRNA在脊髓损伤临床应用的报道仍然比较有限，仍有问题需要解决，例如缺乏分子机制之间的相互联系，揭示相关microRNA在脊髓损伤中的调控网络与调控模式。脊髓损伤治疗策略的另一个主要限制是药物运输系统。高分子微球是天然高分子材料为载体包裹或吸附药物制备的粒径在1-500μm之间的微小球状实体，可降解的天然高分子材料具有安全无毒、易修饰等特性近年来备受关注。并且由于具有侵袭性小，提供持续的局部药物释放，避免全身应用可能产生的副作用，避免使用病毒载体，注射剂量的个性化以及生物可降解性等优点，已经成为治疗脊髓损伤的药物运输新途径。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种MicroRNA微纳米球的制备方法及其在脊髓损伤修复中的应用，通过生物高分子聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球结合调控多种MicroRNA表达，脊髓损伤后形成有利于再生的局部微环境，促进脊髓损伤后修复。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种MicroRNA微纳米球的制备方法，包括：采用复乳法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球溶液；将聚醚酰亚胺水溶液加入到聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球溶液充分振荡混匀形成聚醚酰亚胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球复合物溶液；将不同的MicroRNAs负载到微球上，形成MicroRNAs微球复合物。进一步地，所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球溶液的具体制备方法为：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中得到10％的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，同时分别制备7％和1％的聚乙烯醇水溶液；将10％的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和7％聚乙烯醇溶液混合并超声产生乳状液，然后将乳状液加入1％的聚乙烯醇溶液继续超声，并持续搅拌以去除二氯甲烷，最后用双蒸水洗涤，并重悬于双蒸水中保存，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球溶液。进一步地，所述的聚醚酰亚胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球复合物溶液的具体制备方法为：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球水溶液与聚醚酰亚胺共溶于ddH2O，得到的溶液加入到聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球溶液中，稍加涡旋，制得聚醚酰亚胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球复合物溶液。进一步地，所述的MicroRNAs为miR-93、miR-9、miR-132、miR-124、miR-126，其核苷酸序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:10所示。进一步地，所述的超声采用超声破碎仪。进一步地，用双蒸水洗涤时，采用离心机在13000rpm条件下离心3分钟。进一步地，所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球重悬于双蒸水中于4℃保存。本专利技术还提供上述的方法制备的MicroRNA微纳米球在脊髓损伤修复中的应用。研究发现，治疗脊髓损伤的方法主要在于对抗级联发生的继发性损伤使其向有利于再生的局部微环境转变，主要包括刺激运动神经元的轴突再生，促进运动神经元内在再生能力的转录调控，抑制细胞免疫靶点调节免疫炎症反应，抑制星形胶质细胞聚集导致胶质细胞增生性瘢痕形成，以及调节有利于局部血管再生的调控因子。本专利技术的创新学术思想与技术是集miR-93、miR-9、miR-132、miR-124、miR-126的功能，综合调控信号分子在神经元突起生长、轴浆运输、减轻免疫炎症反应、抑制胶质瘢痕形成，促进血管化与再生微环境重建等多靶点多层面进行分子调控，实现脊髓损伤修复后的功能重建。例如，miR-93在脊髓损伤后表达呈上升趋势，通过直接作用于EphA4调控p-ephexin及activeRhoA的活性，促进脊髓运输神经元突起生长。miR-9在神经干细胞向神经元分化过程中起着重要调控作用，可以通过影响转录激活因子STAT3信号通路来促进神经分化，对运动神经元轴突生长有促进作用。miR-132在脑组织发育、树突细胞的起源、突触形成和成熟中均发挥重要作用。靶向作用于乙酰胆碱酯酶的miR-132可以通过减少炎性细胞因子如肿瘤坏死因子及白细胞介素的释放，减轻免疫炎症反应。miR-124在调节胶质母细胞瘤分化和增殖、侵润过程中起重要作用，研究证实能显著抑制胶质细胞增生引发的瘢痕形成，进而减轻继发性损伤过程。miR-126是一种血管内皮细胞特异性表达的microRNA，通过调控Spred-1、VCAM-1、EGFL-7和VEGF等基因表达参与调节血管发育、新生血管形成以及血管炎症反应等病理生理过程。本专利技术所达到的有益效果：本专利技术使用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球含有亲水性基团，酯键断裂后即降解为二氧化碳和水，表面光滑，粒径均一，形态规则，释放速率相对缓慢。通过生物高分子聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球结合调控多种MicroRNA表达，脊髓损伤后形成有利于再生的局部微环境，促进脊髓损伤后修复。附图说明图1是HE染色统计术后不同时间神经组织所占百分比(*P<0.05**P<0.01)。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。实施例1一种MicroRNA微纳米球的制备方法，包括：1.PLGA微纳米球的制备采用复乳法制备微纳米球，即将100mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于1mL二氯甲烷中得到10％的PLGA溶液，同时分别制备7％和1％的聚乙烯醇(PVA)水溶液，将10％的PLGA和7％PVA混合并用超声破碎仪超声1分钟产生乳状液，然后将乳状液加入50mL的1％PVA溶液继续超声3分钟，并持续搅拌24小时去除二氯甲烷，最后用双蒸水洗涤两次(13000rpm离心3分钟)，并重悬于双蒸水中于4℃保存备用。2.含MicroRNAs微本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.MicroRNA微纳米球的制备方法，其特征是，包括：/n采用复乳法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球溶液；/n将聚醚酰亚胺水溶液加入到聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球溶液充分振荡混匀形成聚醚酰亚胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球复合物溶液；/n将不同的MicroRNAs负载到微球上，形成MicroRNAs微球复合物。/n

【技术特征摘要】
1.MicroRNA微纳米球的制备方法，其特征是，包括：
采用复乳法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球溶液；
将聚醚酰亚胺水溶液加入到聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球溶液充分振荡混匀形成聚醚酰亚胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球复合物溶液；
将不同的MicroRNAs负载到微球上，形成MicroRNAs微球复合物。


2.根据权利要求1所述的MicroRNA微纳米球的制备方法，其特征是，所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球溶液的具体制备方法为：
将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷中得到10％的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，同时分别制备7％和1％的聚乙烯醇水溶液；
将10％的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和7％聚乙烯醇溶液混合并超声产生乳状液，然后将乳状液加入1％的聚乙烯醇溶液继续超声，并持续搅拌以去除二氯甲烷，最后用双蒸水洗涤，并重悬于双蒸水中保存，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球溶液。


3.根据权利要求1所述的MicroRNA微纳米球的制备方法，其特征是，所述的聚醚酰亚胺修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微纳米球复合物溶液的...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾晓松，汤欣，
申请(专利权)人：尧舜泽生物医药南京有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32