一种人类精子冷冻保存方法技术

本发明专利技术公开了一种人类精子冷冻保存方法，包括以下步骤：S1、将精液液化，得到液化精液；S2、将S1得到的液化精液洗涤，离心，重复上述操作2～4次，然后在培养箱中培养，得到精子样品；S3、将S2得到的精子样品与海藻糖溶液混匀，得到混合液；S4、将S3得到的混合液与添加剂混合均匀，接着在CO

【技术实现步骤摘要】
一种人类精子冷冻保存方法
本专利技术属于精子保存
，具体涉及一种精子冷冻保存方法。
技术介绍
随着现代文明进步与社会工业化发展，环境污染愈加严重，精液异常增多，导致不育症的发病率已达到10％，成为常见疾病。精子冷冻保存技术一直是保持生育能力和辅助生殖的重要手段。尽管在这一领域已经取得了广泛的进展，但精子在冷冻保存后活力和DNA完整性都有所降低。人类精子低温损伤的机制与冷休克、渗透胁迫、细胞内成冰和氧化应激有关。低温保存过程中产生的过量活性氧(ROS)通过膜脂过氧化、蛋白巯基氧化等机制影响精子的活力和受精能力。氧化应激还可引起精子核基因组DNA断裂。氧化应激是由促氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡引起的，在这种不平衡中，促氧化剂占优势。因此，如何降低冷冻对精子的损伤，是精子冷冻技术中难以突破的瓶颈。研究表明，抗氧化剂槲皮素、维生素E、褪黑激素、还原性谷胱甘肽(GSH)等有助于改善小鼠慢速冷冻和快速冷冻后解冻后精子的活力，然而关于使用抗氧化剂通过玻璃化冷冻保存人类精子的信息有限，且这些抗氧化剂还没有被用于人类精子的冷冻保存技术中。因此，研究抗氧化剂在人类精子冷冻保存方法中应用来改善冷冻后精子的活性是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人类精子冷冻保存方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种人类精子冷冻保存方法，包括以下步骤：S1、将精液液化，得到液化精液；S2、将S1得到的液化精液洗涤，离心，重复上述操作2～4次，然后在培养箱中培养，得到精子样品；S3、将S2得到的精子样品与海藻糖溶液混匀，得到混合液；所述S2得到的精子样品与海藻糖溶液的体积比为1:1；S4、将S3得到的混合液与添加剂混合均匀，接着在培养箱中平衡，然后装入保存容器中，浸入液氮中进行玻璃化冷冻保存；所述S3得到的混合液与冷冻液的体积比为200:1；所述添加剂由以下浓度的组分组成：L-还原型谷胱甘肽15.365～122.92g/L、氯化钠5.7154g/L、氯化钾0.3496g/L、硫酸镁0.0241g/L、磷酸二氢钾0.0504g/L、二水合氯化钙0.3000g/L、碳酸氢钠2.1003g/L、葡萄糖0.5008g/L、丙酮酸钠0.0363g/L、乳酸钠3.9968g/L、硫酸庆大霉素0.0100g/L、人血清白蛋白5g/L，余量为超纯水。优选的，步骤S1中，所述液化温度为25～37℃，液化时间为30～60min。优选的，步骤S2中，所述S1得到的液化精液通过人输卵管液(HumanTubalFluid，HTF)进行洗涤，且所述HTF液由以下浓度的组分组成：氯化钠5.7154g/L、氯化钾0.3496g/L、硫酸镁0.0241g/L、磷酸二氢钾0.0504g/L、二水合氯化钙0.3000g/L、碳酸氢钠2.1003g/L、葡萄糖0.5008g/L、丙酮酸钠0.0363g/L、乳酸钠3.9968g/L、硫酸庆大霉素0.0100g/L、人血清白蛋白5g/L，余量为超纯水；优选的，所述S1得到的液化精液与HTF液的体积比为1:2。优选的，步骤S3中，所述海藻糖溶液的浓度为0.25～1.0mol/L。优选的，步骤S2和S4中，所述培养箱为CO2培养箱。优选的，步骤S4中，所述保存容器为冷冻麦管。本专利技术与现有技术相比，其有益效果在于：(1)本专利技术提供的精子冷冻保存方法可增强冷冻后精子的复苏率和前向运动百分率，降低氧DNA损伤，改善冻后精液质量；(2)本专利技术提供的精子冷冻保存方法通过加入海藻糖溶液，将非渗透低温保护剂海藻糖这种天然糖，应用于精子冷冻保存，避免了渗透低温保护剂如甘油对人体精子的不利影响；(3)本专利技术提供的精子冷冻保存方法通过加入添加剂，能够将抗氧化剂谷胱甘肽引入精子冷冻保存，中和了精子冷冻保存过程中产生的氧化应激反应；(4)本专利技术通过对海藻糖溶液和添加剂中谷胱甘肽浓度的调控，对冻后精子的活性进行研究，研究结果表明，当海藻糖溶液和谷胱甘肽浓度分别为0.5mol/L和100mM时，冷冻后的精子具有最优的复苏率和前向运动百分率。附图说明图1为本专利技术实施例中的管中管系统的示意图。具体实施方式为了使本领域技术人员更好地理解本专利技术的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。下面各实施例中未注明具体条件的试验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行，所用原料均为市售。以下实施例中的HTF液由以下浓度的组分组成：氯化钠5.7154g/L、氯化钾0.3496g/L、硫酸镁0.0241g/L、磷酸二氢钾0.0504g/L、二水合氯化钙0.3000g/L、碳酸氢钠2.1003g/L、葡萄糖0.5008g/L、丙酮酸钠0.0363g/L、乳酸钠3.9968g/L、硫酸庆大霉素0.0100g/L、人血清白蛋白5g/L，余量为超纯水。且HTF液通过以下方法制备得到：将各组分依次分别溶于超纯水中，人血清白蛋白最后加入，待完全溶解后定容，于超净台内0.22μm孔径滤膜过滤得到，pH维持在7.2～7.8，于-80℃超低温冰箱保存；实施例1一种人类精子冷冻保存方法，具体包括以下步骤：S1、采用常规方法取得精液，直接收集在无菌取精杯内，然后将精液在25℃下液化，得到液化精液；S2、将S1得到的液化精液与HTF液按照体积比1:2混合进行洗涤，然后在400g下离心10min，去除上部液体，重复上述操作2次，然后在CO2培养箱中培养，得到精子样品；S3、将S2得到的精子样品与海藻糖溶液按照体积比1:1混匀，得到混合液，混合液中精子的最终浓度为15-20×106/mL；其中海藻糖溶液的浓度为0.5mol/L；海藻糖溶液的具体制备方法为：称取海藻糖1.8917g，完全溶解于超纯水中，接着加超纯水使最终体积为10mL，混匀后于超净台内0.22μm孔径滤膜除菌过滤，无菌分装得到，然后在4℃或室温条件下避光保存；S4、将S3得到的混合液与添加剂按照体积比为200:1混合均匀，接着在CO2培养箱中平衡10min，将50μL精子样本加载到管中管系统，如图1所示，管中管系统是由标准的0.25mL麦管(美国IMV技术目录#005565)和标准的0.5mL麦管(IMVTechnologies,USA,catalog#005569)组成，具体加载方法为：将精子样本加载到标准的0.25mL麦管的中间部分，接着将装载有精子样本的0.25mL麦管放入标准的0.5mL吸管中，其插头端在同一侧，将0.5mL麦管的插头端热封后，用脉冲封口机将0.25ml和0.5mL麦管的开口端一起热封，然后直接水平浸入液氮(LN2，-196℃)中进行玻璃化冷冻保存；所述添加剂具体由以下浓度的组分组成：L-还原型谷胱甘肽30.73g/L(100mM)、氯化钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人类精子冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、将精液液化，得到液化精液；/nS2、将S1得到的液化精液洗涤，离心，重复上述操作2～4次，然后在培养箱中培养，得到精子样品；/nS3、将S2得到的精子样品与海藻糖溶液混匀，得到混合液；/n所述S2得到的精子样品与海藻糖溶液的体积比为1:1，且所述海藻糖溶液的浓度为0.25～1.0mol/L；/nS4、将S3得到的混合液与添加剂混合均匀，接着在培养箱中平衡，然后装入保存容器中，浸入液氮中进行玻璃化冷冻保存；所述S3得到的混合液与冷冻液的体积比为200:1；/n所述添加剂由以下浓度的组分组成：/nL-还原型谷胱甘肽15.365～122.92g/L、氯化钠5.7154g/L、氯化钾0.3496g/L、硫酸镁0.0241g/L、磷酸二氢钾0.0504g/L、二水合氯化钙0.3000g/L、碳酸氢钠2.1003g/L、葡萄糖0.5008g/L、丙酮酸钠0.0363g/L、乳酸钠3.9968g/L、硫酸庆大霉素0.0100g/L、人血清白蛋白5g/L，余量为超纯水。/n

【技术特征摘要】
1.一种人类精子冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将精液液化，得到液化精液；
S2、将S1得到的液化精液洗涤，离心，重复上述操作2～4次，然后在培养箱中培养，得到精子样品；
S3、将S2得到的精子样品与海藻糖溶液混匀，得到混合液；
所述S2得到的精子样品与海藻糖溶液的体积比为1:1，且所述海藻糖溶液的浓度为0.25～1.0mol/L；
S4、将S3得到的混合液与添加剂混合均匀，接着在培养箱中平衡，然后装入保存容器中，浸入液氮中进行玻璃化冷冻保存；所述S3得到的混合液与冷冻液的体积比为200:1；
所述添加剂由以下浓度的组分组成：
L-还原型谷胱甘肽15.365～122.92g/L、氯化钠5.7154g/L、氯化钾0.3496g/L、硫酸镁0.0241g/L、磷酸二氢钾0.0504g/L、二水合氯化钙0.3000g/L、碳酸氢钠2.1003g/L、葡萄糖0.5008g/L、丙酮酸钠0.0363g/L、乳酸钠3.9968g/L、硫酸庆大霉素0.0100g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡焕焕，姬国杰，石晓卫，刘瑞，李明文，张靖，张晗，王朋博，秦冰鑫，兰庆凯，沈宇杰，
申请(专利权)人：新乡医学院三全学院，
类型：发明
国别省市：河南;41