通过质谱法评价SDHB蛋白表达制造技术

本发明专利技术提供了用于检测和定量表达SDHB蛋白的方法。在从肿瘤组织收集的肿瘤细胞中直接通过DIA‑质谱精确检测和定量特定的蛋白的片段肽，所述肿瘤组织获自受试者，例如癌症患者。该方法的结果可用于帮助选择癌症疗法。

【技术实现步骤摘要】
通过质谱法评价SDHB蛋白表达相关专利申请的交叉引用本专利申请要求在2019年1月11日提交的美国临时专利申请第62/791,495号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
本专利技术提供了新的和改进的用于测量SDHB蛋白表达的方法。所述方法使用以数据无关采集(DIA)模式进行的液相色谱-质谱(LC-MS)。该方法允许检测癌症患者肿瘤组织中，特别是胃肠道间质瘤(GIST)中的特异性SDHB片段肽，并且可以用作改进的癌症治疗方法的一部分。例如，所述方法可用于识别对包括但不限于伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、达卡巴嗪和替莫唑胺的治疗方案将响应或最可能响应的患者。
技术介绍
琥珀酸脱氢酶铁-硫亚单位线粒体(Succinatedehydrogenaseiron-sulfursubunit,mitochondrial)(SDHB)，也称为复合物II(Ip)的铁-硫亚基，是一种蛋白质，其在人体中是琥珀酸脱氢酶(也称为SDH或复合物II)蛋白质复合物的一部分，该复合物催化琥珀酸的氧化(琥珀酸+泛醌→富马酸+泛醇)。SDHB是一起形成琥珀酸脱氢酶的四个蛋白质亚基之一，其它三个是SDHA、SDHC和SDHD。SDHB亚单位在SDH复合物的亲水性催化端上连接到SDHA亚单位。它还与复合物疏水端上锚定在线粒体膜内的SDHC/SDHD亚单位连接。SDHB亚基是具有三个铁硫簇的铁硫蛋白。虽然SDHB蛋白在线粒体的内膜中表达，SDHB基因是核型的，而不是线粒体。表达的蛋白质重18.6kDa，由180个氨基酸组成。SDHB包含使电子隧穿通过络合物所必需的铁-硫簇。它位于SDHA和两个跨膜亚单位SDHC和SDHD之间。SDH复合物位于线粒体的内膜上，参与柠檬酸循环和呼吸链。SDHB作为碱性SDH酶的中间体。SDHB基因是一种肿瘤抑制基因，通过突变和/或蛋白表达的丧失而丧失所述基因允许肿瘤发生的起始和进展。因此，确定蛋白表达损失的方法不仅有助于潜在地确定肿瘤发生的水平，而且可以用于确定治疗的选择。
技术实现思路
本专利技术提供了利用片段肽分析的数据无关采集(DataIndependentAcquisition)(DIA)模式，通过质谱法检测来自SDHB蛋白的一个或多个片段肽的存在的方法。片段肽可以是SEQIDNO：1-12中所示的序列，其来源于全长SDHB蛋白。提供了检测福尔马林固定组织的生物样品中SDHB蛋白表达的方法，包括使用质谱法检测和/或定量从所述生物样品制备的蛋白质消化物中源自SDHB蛋白的一个或多个片段肽的含量；并计算所述生物样品中蛋白的水平。片段肽可以选自SEQIDNO：1-12的肽，也可以是1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、11个或更多或SEQIDNO：1-12的所有12个序列。在检测和/或定量一种或多种片段肽的含量之前，可以选择性地将蛋白质消化物分级。分级的步骤可以是例如液相色谱、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱。蛋白质消化物可以是蛋白酶消化物，例如胰蛋白酶消化物，并且有利地，生物样品的蛋白质消化物可以通过液体组织方案(Liquidprotocol)制备。组织可以是福尔马林固定的组织，并且可选地可以是石蜡包埋的。所述组织可以从肿瘤，例如原发性或继发性肿瘤获得。质谱分析可以包括串联质谱分析、离子阱质谱分析、三重四极杆质谱分析、离子阱/四极杆混合质谱分析、MALDI-TOF质谱分析、MALDI质谱分析和飞行时间质谱分析中的一种或多种。有利地，所使用的质谱分析模式是数据无关采集(DIA)。例如，通过将一个生物样品中的片段肽的含量与不同且单独的生物样品中的相同片段肽的含量进行比较，可以定量一种或多种片段肽。检测和/或定量蛋白质消化物中至少一个片段肽的含量表明SDHB蛋白的存在和与癌症的诊断阶段/等级/状况在从其获取样品的受试者中的关联。检测和/或定量至少一种片段肽的含量或相应蛋白的水平可以用作受试者的癌症治疗疗法的改进方法的一部分。所述相关性还可以与以多重形式检测和/或定量其它蛋白质或来自其它蛋白质的肽的含量结合，以提供用于受试者的癌症治疗的改进方法。具体实施方式琥珀酸脱氢酶(SDH)复合物是由四个亚基组成的关键呼吸酶：SDHA、SDHB、SDHC和SDHD。值得注意的是，只要存在SDH的任何组分的双等位失活，SDHB的免疫组织化学就变为阴性，这在不存在综合征性疾病时非常罕见。因此，SDHB免疫组织化学的丧失作为综合症疾病的标志，通常是SDH亚基之一的种系突变。显示SDHB表达丧失的肿瘤被称为琥珀酸脱氢酶缺陷的。除了SDHB的丢失，与SDHA突变相关的肿瘤也显示SDHA表达的丢失。15％的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PHEO/PGL)与种系SDH突变相关，因此是SDH-缺陷型。SDH-缺陷型胃肠道基质肿瘤(GIST)显示出独特的特征，包括不存在KIT原癌基因受体酪氨酸激酶/血小板衍生生长因子受体A(KIT/PDGFRA)突变(但对cKIT和DOG1阳性染色)，实际上是排他性胃位(exclusivegastriclocation)、分叶状生长(lobulatedgrowth)、多灶性(multi-focality)、不能通过大小和有丝分裂速率预测的预后、频繁转移到淋巴结和对伊马替尼(imatinib)疗法的原发性抗性。30％与SDHA种系突变有关，50％与SDHC表突变(合子后启动子超甲基化(post-zygoticpromoterhypermethylation))有关——综合征的标志，但非遗传性Carney三联体(SDH-缺陷型GIST，SDH-缺陷型副神经节瘤和肺软骨瘤)。SDH-缺陷型肾癌显示有空泡的嗜酸性细胞质和细胞质包涵体。它特别与SDHB突变有关，尽管发生SDHC和SDHA突变。SDH-缺陷的垂体腺瘤是公认的，但似乎是最不常见的SDH-缺陷的肿瘤。副神经节瘤是由SDHB突变引起的，证明缺乏SDHB蛋白表达，并具有几个其它区别特征。恶性肿瘤是常见的，在突变携带者中的范围为38％-83％。相反，由SDHD突变引起的肿瘤几乎总是良性的。散发性的副神经节瘤在少于10％的病例中是恶性的。SDHB引起的恶性副神经节瘤通常是肾上腺外(extra-adrenal)的(所有病例的92％)，而散发性的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤在少于10％的病例中是肾上腺外的。该基因的外显率在50岁时经常报道为77％(即77％的携带者在50岁时将具有至少一个肿瘤)。SDHB与非SDHB相关疾病的平均发病年龄大致相同(大约36岁)。与SDHC和SDHD基因一样，SDHB是肿瘤抑制基因，通过突变和/或蛋白表达的缺失导致的基因缺失允许肿瘤发生的起始和进展。SDHA基因不是肿瘤抑制基因。肿瘤形成通常遵循Knudson“两次命中”假说。该基因的第一个拷贝在所有细胞中突变，而第二个拷贝正常发挥功能。当第二个拷贝在特定细胞中由于随机事件而突变时，杂合性丢失(LOH)发生并且SDHB蛋白不再产生。然后，肿瘤形本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测福尔马林固定组织的生物样品中琥珀酸脱氢酶铁-硫亚单位线粒体(SDHB)蛋白表达的方法，所述方法包括/n使用质谱法检测和/或定量一种或多种片段肽的含量，所述一种或多种片段肽源自从所述生物样品制备的蛋白质消化物中的SDHB蛋白；并计算所述生物样品中所述蛋白的水平。/n

【技术特征摘要】
20190111 US 62/791,4931.检测福尔马林固定组织的生物样品中琥珀酸脱氢酶铁-硫亚单位线粒体(SDHB)蛋白表达的方法，所述方法包括
使用质谱法检测和/或定量一种或多种片段肽的含量，所述一种或多种片段肽源自从所述生物样品制备的蛋白质消化物中的SDHB蛋白；并计算所述生物样品中所述蛋白的水平。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括在检测和/或定量所述一种或多种片段肽之前对所述蛋白质消化物进行分级的步骤。


3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述分级的步骤选自由凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反相液相色谱、高效液相色谱和反相高效液相色谱组成的组。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质消化物包含蛋白酶消化物，优选胰蛋白酶消化物。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述质谱包括串联质谱、离子阱质谱、三重四极杆质谱、离子阱/四极杆混合质谱、MALDI-TOF质谱、MALDI质谱和/或飞行时间质谱。


6.根据权利要求5所述的方法，其中，所使用的质谱模式是数据无关采集(DIA)。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种片段肽选自由SEQIDNO：1-12组成的组。


8.根据前述权利要求中任一项所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·J·金姆，A·G·钱伯斯，
申请(专利权)人：南坦生物组学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US