用于肿瘤组织分子谱的SRM/MRM测定制造技术

本发明专利技术提供了在获自受试者的福尔马林固定的肿瘤组织的生物样品中建立蛋白质表达谱的方法。本发明专利技术提供的SRM/MRM测定可用于检测和定量直接在受试者的肿瘤组织中参与细胞过程的蛋白质，所述细胞过程包括细胞分裂、细胞分化、细胞生长抑制、细胞代谢、细胞信号传导和肿瘤免疫应答/调节。SRM/MRM测定可以不管表达的细胞来源，提供整个组织微环境的肿瘤组织概况，告知受试者的最佳癌症疗法治疗。

【技术实现步骤摘要】
用于肿瘤组织分子谱的SRM/MRM测定相关专利申请的交叉引用本专利申请要求在2019年1月11日提交的美国临时专利申请第62/791,495号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
本专利技术提供了用于对从受试者，例如癌症患者，获得的肿瘤组织进行基于质谱的定量蛋白质组分析以获得个性化肿瘤概况的方法。对受试者的肿瘤组织进行的这些蛋白质测定检测和定量可以：1)与对基于免疫的癌症疗法的阳性或阴性应答相关联，其中，所述测定可以有效地预测对基于免疫的癌症疗法的阳性或阴性应答，2)与对分子靶向的癌症疗法的阳性或阴性应答相关联，其中，所述测定可以预测对分子靶向的癌症疗法的阳性或阴性应答，3)启动、抑制、维持、促进和/或以其他方式调节患者自身的免疫系统以攻击患者自身的肿瘤细胞。由这些方法提供的受试者的肿瘤组织的蛋白质组图谱用作改进的癌症治疗方法的一部分，所述方法使用设计成特异性攻击和杀伤肿瘤细胞或操纵受试者的肿瘤免疫应答以杀伤肿瘤细胞的癌症治疗剂。
技术介绍
在肿瘤细胞中异常表达并驱动肿瘤细胞生长和存活的蛋白的小分子和生物抑制剂(癌症生物标志物)用作针对多种癌症的治疗剂。异常表达并驱动肿瘤细胞生长和存活的癌症生物标志物蛋白的实例包括Met、IGF-1R和Her2。已经开发了与这些蛋白质直接相互作用的癌症治疗剂。因此，直接在患者肿瘤组织中检测这些蛋白质的表达和定量这些蛋白质可以用作治疗方案的一部分，以选择和施用将抑制这些蛋白质的功能、阻止肿瘤细胞生长和促进总体患者存活的治疗剂或试剂的组合。通过质谱-SRM/MRM分析来源于通过组织显微解剖从患者肿瘤组织提取的肿瘤细胞中的表达蛋白质的特定蛋白酶解肽，可以有效地进行肿瘤组织中(尤其是存在于这种组织中的肿瘤细胞中)的蛋白质的精确检测和定量。在单一SRM/MRM测定中一次定量此类蛋白质组，提供了蛋白质表达景观的“图谱”或“标签”，以告知靶向肿瘤细胞的癌症治疗剂。作为靶向治疗剂治疗方案的一部分，定量测定的实例包括IGF-1R蛋白(参见美国专利8,728,753)和cMet蛋白(参见美国专利9,372,195)。设计用于特异性抑制驱动癌症过程的蛋白质的功能，从而阻止肿瘤细胞生长的癌症治疗剂的另一个实例是曲妥单抗(Trastuzumab)。曲妥单抗，以商标出售，是一种单克隆抗体，主要用于治疗乳腺癌，也用于治疗在肿瘤组织内的肿瘤细胞中表达Her2受体蛋白的其它癌症。曲妥单抗结合Her2受体蛋白胞外片段的结构域IV。用曲妥珠单抗处理的肿瘤细胞在细胞周期的G1期期间停止生长，因此，增殖减少。已经表明曲妥单抗不改变HER-2基因表达，但下调AKT的激活。此外，曲妥珠单抗通过诱导抗血管生成因子和抑制促血管生成因子抑制血管生成。据说对癌症中观察到的生长失控的贡献可能是由于Her2蛋白的蛋白水解切割导致细胞外结构域的释放。曲妥单抗还显示抑制乳腺癌细胞中Her2胞外域的切割，这也有助于抑制肿瘤细胞生长。制药工业正在研究表征癌症患者肿瘤免疫应答的蛋白质。这些蛋白在许多不同的细胞类型中正常和异常表达，包括肿瘤细胞、实体组织中的良性细胞和血液产生的淋巴细胞的各种谱系。这些蛋白的功能是启动、增强、调节或抑制患者自身对他/她自身肿瘤细胞的免疫应答。尽管这些蛋白质中的每一种具有不同的功能，但是它们对免疫系统的作用可以取决于哪个细胞表达该蛋白质。在正常情况下，免疫系统通过自身与非自身识别的复杂分子信号传导过程来根除肿瘤细胞，所述自身与非自身识别是通过淋巴细胞依赖性肿瘤细胞杀伤介导的。然而，这种复杂过程可被寻求逃避免疫监视的肿瘤细胞破坏。已经开发了与这些蛋白质相互作用的小分子和生物治疗剂，以便操纵免疫系统攻击和杀死肿瘤细胞。成功施用靶向免疫调节治疗剂将极大地受益于患者免疫系统状况的蛋白质表达“图谱”或“标签”，以确定哪些靶蛋白质在组织内表达。然后，该免疫谱可以告知哪种治疗剂或药物组合将最可能提供最大机会来装备、调节、操纵和/或支持患者针对肿瘤细胞的免疫系统以获得最佳患者结果。设计用于操纵患者免疫系统的一类癌症治疗剂的实例是被称为免疫检查点抑制剂的化合物集合，它与被称为免疫检查点蛋白的蛋白质集合相互作用。PD-1蛋白是通常存在于被称为T细胞的淋巴细胞上的免疫检查点蛋白，充当帮助防止T细胞攻击身体中的其他细胞的一种“关闭开关”。当它附着到PD-L1(一种存在于一些正常(和癌)细胞表面的蛋白质)上时，它就这样做。当PD-1与PD-L1结合时，它发信号给T细胞使其不攻击表达PD-L1的细胞。一些癌细胞具有大量的PD-L1，使它们被免疫系统屏蔽，从而允许它们逃避免疫监视并防止来自T细胞的攻击。靶向PD-1或PD-L1的单克隆抗体可以暴露癌细胞，从而加强针对癌细胞的免疫应答。这种癌症治疗策略已经在治疗某些癌症中显示出很大的希望，并且PD-1抑制剂的实例包括派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)。这些药物已显示有助于治疗几种类型的癌症，包括黑素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、头颈癌和霍奇金淋巴瘤。它们也被研究用于对抗许多其它类型的癌症。PD-L1抑制剂的一个实例是阿替唑珠单抗(atezolizumab)，其目前用于治疗膀胱癌，并且还正在研究用于对抗其它类型的癌症。许多靶向PD-1或PD-L1的其它药物现在也在临床试验中进行测试，包括单独试验或与其它药物组合试验。这些实施例证明了如何将肿瘤细胞和免疫系统细胞的分子状态的知识用作有效的靶向的基于免疫的癌症治疗策略的一部分。直接从患者肿瘤组织切片获得同质细胞群以用于组织学上特定细胞群的分子谱分析的能力是高度有利的，由此，例如，可以研究可能存在于包括正常上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞的其他类型细胞内的肿瘤细胞。激光捕获显微切割(LaserCaptureMicrodissection，LCM)技术(参见美国专利6,867,038)可用于将肿瘤组织的分子分析分成精确限定的细胞群。LCM以及其它市售组织显微解剖技术，包括DIRECTOR技术(美国专利7,381,440)，通过允许将源自组织样品的细胞的分子谱置于病理相关背景下，改进了组织样品的分析。
技术实现思路
提供了SRM/MRM测定，其可用于检测和定量直接从癌症患者肿瘤组织制备的蛋白质组裂解物中特定蛋白质的水平。这些蛋白质可用于癌症治疗的选择，并作为治疗方案的一部分。被分析的蛋白质提供肿瘤细胞的起始和生长，并且这些蛋白质的细胞位置包括但不限于生长因子、生长因子受体、细胞信号受体、细胞间通讯蛋白、细胞结构蛋白、转录因子、核酸加工蛋白、DNA合成蛋白、DNA修复蛋白、细胞分裂蛋白、信号途径蛋白、代谢途径蛋白质、分泌蛋白、细胞膜蛋白、细胞质蛋白、核蛋白、膜结合蛋白和蛋白翻译蛋白。这些蛋白质可以是治疗剂的靶标、患者对特定治疗剂的结果的预测物和/或癌症患者免疫系统的调节剂。本专利技术所述的SRM/MRM测定可用于直接在患者肿瘤组织中开发肿瘤细胞的个性化分子谱。一旦确定了这些蛋白的表达状态，则可将特定治疗剂给予患者，由此这些试剂可与通过本专利技术所述SRM/MRM测定检测和测量的蛋白相互作用，并抑制或增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在获自受试者的福尔马林固定的肿瘤组织的生物样品中建立蛋白质表达谱的方法，所述方法包括/n使用质谱分析检测和/或定量所述生物样品制备的蛋白质消化物中一种或多种片段肽的含量；以及计算所述生物样品中的相应的一种或多种蛋白质的含量；/n其中，所述生物样品为福尔马林固定的肿瘤组织的生物样品；/n其中，所述一种或多种蛋白质选自由CDK12、CHD4、CLDN18.2、CSNK1A1、EZR、FAK1、FAS、FTH1、INSR、JAK1、LDHA、LDHB、MICA、MICB、N-Myc、NRP1、PAK1、PARP2、PDK2、SELL、SMARCA2、STEAP1、SYK、TP53BP1、TROP2、ULBP3、XPF、ASS1、MELF、RNF43、CLDN6、CLDN9、DPEP3和GPC1组成的组。/n

【技术特征摘要】
20190111 US 62/791,4861.一种在获自受试者的福尔马林固定的肿瘤组织的生物样品中建立蛋白质表达谱的方法，所述方法包括
使用质谱分析检测和/或定量所述生物样品制备的蛋白质消化物中一种或多种片段肽的含量；以及计算所述生物样品中的相应的一种或多种蛋白质的含量；
其中，所述生物样品为福尔马林固定的肿瘤组织的生物样品；
其中，所述一种或多种蛋白质选自由CDK12、CHD4、CLDN18.2、CSNK1A1、EZR、FAK1、FAS、FTH1、INSR、JAK1、LDHA、LDHB、MICA、MICB、N-Myc、NRP1、PAK1、PARP2、PDK2、SELL、SMARCA2、STEAP1、SYK、TP53BP1、TROP2、ULBP3、XPF、ASS1、MELF、RNF43、CLDN6、CLDN9、DPEP3和GPC1组成的组。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括在检测和/或定量所述一种或多种片段肽的含量之前分级分离所述蛋白质消化物的步骤。


3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述分级分离步骤选自由液相色谱、纳米反相液相色谱、高效液相色谱和反相高效液相色谱组成的组。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质消化物包含蛋白酶消化物，优选胰蛋白酶消化物。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述质谱分析包括串联质谱分析、离子阱质谱分析、三重四极杆质谱分析、混合离子阱/四极杆质谱分析、MALDI-TOF质谱分析、MALDI质谱分析和/或飞行时间质谱分析。


6.根据权利要求5所述的方法，其中，所使用的质谱分析模式是选择反应监测(SRM)、多重反应监测(MRM)、智能选择反应监测(iSRM)、并行反应监测(PRM)和/或多重选择反应监测(mSRM)。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种片段肽选自由SEQIDNO：1-59的肽组成的组。


8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述组织是石蜡包...

【专利技术属性】
技术研发人员：托德·A·哈姆布拉夫，法比奥拉·切基，K·M·斯科特，S·施瓦兹，
申请(专利权)人：南坦生物组学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US