可视化检测肿瘤外泌体的新型纳米杂化物探针的制备方法技术

本发明专利技术公开了可视化检测肿瘤外泌体的新型纳米杂化物探针的制备方法，基于铜离子配位黑磷量子点(Cu‑BPQDs)和有机荧光染料(Cy5)制备了新型双发射纳米杂化物载体探针，该探针可用于乳腺癌外泌体的可视化半定量检测。在探针的水分散液中加入含有外泌体的样品，引起探针表面DNA分子阀门开启，负载的电子受体分子释放，Cu‑BPQDs蓝色荧光从淬灭转为荧光恢复，此过程对Cy5红色荧光影响甚微。随着样品中外泌体浓度的增大，探针‑样品混合分散液的荧光颜色逐渐从红色转为蓝色，包括多种中间过渡色。建立样品中外泌体浓度与探针‑样品混合分散液的荧光颜色类型之间的关联，发展可视化检测肿瘤外泌体的新方法。

【技术实现步骤摘要】
可视化检测肿瘤外泌体的新型纳米杂化物探针的制备方法
：本专利技术属于多功能纳米杂化物和肿瘤外泌体检测探针的制备
，具体涉及一种基于铜离子配位黑磷量子点和有机荧光染料的新型双发射纳米杂化物载体探针的制备方法，其制备的探针可用于乳腺癌外泌体的可视化半定量检测。
技术介绍
：近年来的科学研究表明，肿瘤外泌体是一种新型的生物标志物，可广泛用于不同癌症的早期筛查和临床诊断。对肿瘤外泌体的有效检测，在一定程度上可避免癌症常规检测过程中存在的侵入式筛选，克服检测成本高、检测敏感度低等问题。外泌体是一种直径为50～100nm的细胞外囊泡，是经过內溶体途径从多囊体中释放出来的。由于外泌体从亲本细胞中携带了生物大分子，如mRNA、DNA、跨膜和胞质蛋白等，外泌体可作为介导细胞间信息的信使，在疾病诊断，尤其是在癌症相关生理状态改变的检测方面发挥了重要作用。现有的肿瘤外泌体检测技术主要包括纳米颗粒追踪分析、流式细胞术、表面等离子共振法、比色分析法、发光分析法、电化学分析法等。金芳芳等公开了一种流式细胞仪检测外泌体的方法(金芳芳；王延博；徐学博；陈张朋；薛姜飞.一种流式细胞仪检测外泌体的方法.国家专利技术专利.公开号CN110702589A)。何农跃等公开了一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光(FL)检测传感器(何农跃；黄蓉蓉；李智洋.一种基于分支滚环扩增的外泌体FL检测传感器.国家专利技术专利.公开号CN110396536A)。Zhang等报导了Ti3C2MXenes纳米片催化的电致化学发光生物传感器检测外泌体(HuixinZhang,ZonghuaWang,QiuxiaZhang,FengWang,YangLiu.Ti3C2MXenesnanosheetscatalyzedhighlyefficientelectrogeneratedchemiluminescencebiosensorforthedetectionofexosomes.BiosensorsandBioelectronics,2019,124–125,184–190)。Doldán等报导了基于表面标志物介导信号放大的电化学三明治免疫传感器用于检测外泌体(XimenaDoldán,PabloFagúndez,AlfonsoCayota,JustoLaíz,JuanPabloTosar,Electrochemicalsandwichimmunosensorfordeterminationofexosomesbasedonsurfacemarker-mediatedsignalamplification,AnalyticalChemistry,2016,88,10466-10473)。尽管有关外泌体检测的技术已有文献资料报导，但现有的外泌体检测技术仍然存在瓶颈，急需在纳米级肿瘤外泌体的选择性、灵敏性、可视化分析、定量检测等领域取得进展。基于此，本专利技术公开了一种基于铜离子配位黑磷量子点(Cu-BPQDs)和五甲川菁类FL染料Cy5的新型绿/红双发射FL纳米杂化物载体探针的制备方法，该纳米探针可用于乳腺癌外泌体的比率FL可视化半定量检测。截止目前，尚未检索到有关基于Cu-BPQDs/Cy5的纳米杂化物载体探针的制备，以及基于纳米杂化物载体探针可视化检测肿瘤外泌体的国内外文献和专利报道。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的不足，设计一种高选择性、高灵敏性、可视化分析和半定量检测乳腺癌外泌体的新方法。为实现上述目的，本专利技术涉及的可视化检测肿瘤外泌体的新型纳米杂化物探针的制备方法，其制备方法包括以下步骤：1.可视化检测肿瘤外泌体的新型纳米杂化物探针的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：(1)铜离子配位黑磷量子点(Cu-BPQDs)的制备：将25mg黑磷晶体加入30mL氮甲基吡咯烷酮中，加入1mol/L硝酸铜水溶液5mL，加入溶解了5mg巯基丙酸的水溶液5mL，磁力搅拌形成均质混合液。将混合液用超声波细胞粉碎仪处理2h，再用超声波清洗器水浴处理6h。将处理后的分散液转入微型磁力高压反应釜中，在N2保护下加热至120℃，连续搅拌反应12h。反应产物冷却至室温，在5000rpm转速下离心10min，取上层清液在14000rpm转速下离心15min。离心后的沉淀物用乙醇和二次蒸馏水冲洗3次，真空干燥得到羧基功能化Cu-BPQDs。(2)Cy5内包封二氧化硅纳米球(Cy5-SiO2)的制备：将聚乙二醇氨基PEG-NH2功能化Cy5溶于无水乙醇，加入(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTS)，搅拌均匀，放置避光处。加入氨水与乙醇，搅拌均匀，加入正硅酸乙酯(TEOS)继续搅拌，再加入TEOS进行反应。反应产物经离心、乙醇洗涤和干燥后制得Cy5内包封SiO2纳米球。将其分散在APTS与醋酸的混合液中，在室温下执行搅拌反应，产物经离心、洗涤和干燥，得到表面氨基功能化Cy5-SiO2纳米球。(3)Cy5-SiO2/Cu-BPQDs/mSiO2复合物(Complex)的制备：将N-羟基硫代琥珀酸亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)盐酸盐分散在磷酸盐水(PBS)缓冲液中，加入氨基功能化Cy5-SiO2纳米球，搅拌均匀，放置避光处。磁力搅拌下将羧基功能化Cu-BPQDs水分散液加入混合液中，搅拌反应。产物经离心、洗涤和干燥后制得Cy5-SiO2/Cu-BPQDs杂化物。将此杂化物溶于无水乙醇，加入十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)和APTS，搅拌反应，放置避光处。加入氨水与乙醇后搅拌均匀，加入TEOS搅拌，再加入TEOS继续反应。加入NH4NO3洗脱模板DTAB，产物经离心、乙醇洗涤和干燥后制得氨基功能化Complex。(4)纳米杂化物载体探针(Complex-5Fu-DNA1/DNA2)的制备：向PBS缓冲液中加入偶联剂NHS和EDC盐酸盐，加入氨基功能化Complex，搅拌反应，添加一端为-COOH另一端为-SH的单链DNA1即HS-DNA1-COOH，在室温下搅拌反应。反应产物经透析、除溶剂、离心、洗涤和干燥制得杂化物Complex-DNA1。采用水浴孵化，电子受体分子如5-氟尿嘧啶(5Fu)或多巴胺(DA)进入mSiO2孔道内，完成电子受体分子的负载，如形成Complex-5Fu-DNA1。添加DNA1的互补链DNA2，由于两条DNA单链的碱基互补配对形成双螺旋结构，将电子受体分子封装在mSiO2孔道内，制得Complex-5Fu-DNA1/DNA2。(5)将此纳米杂化物载体探针分散于PBS缓冲液中，加入含有肿瘤外泌体的水分散液或生物流体样品，磁力搅拌均匀。将此载体探针与含有外泌体的样品形成的混合分散液，用滴管转移至玻璃比色皿中，或滴涂在聚酰亚胺柔性薄膜上。采用365nm波长紫外光激发照射，用智能手机拍摄比色皿中和柔性薄膜上混合分散液的FL颜色。建立混合分散液的FL颜色类型与混合分散液中肿瘤外泌体浓度的关联，构建样品的FL颜色类型变化与样品中肿瘤外泌体浓度的对应关系，进而发展基于新型纳米杂化物探针的可视化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.可视化检测肿瘤外泌体的新型纳米杂化物探针的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：/n(1)铜离子配位黑磷量子点(Cu-BPQDs)的制备：将25mg黑磷晶体加入30mL氮甲基吡咯烷酮中，加入1mol/L硝酸铜水溶液5mL，加入溶解了5mg巯基丙酸的水溶液5mL，磁力搅拌形成均质混合液；将混合液用超声波细胞粉碎仪处理2h，再用超声波清洗器水浴处理6h；将处理后的分散液转入微型磁力高压反应釜中，在N

【技术特征摘要】
1.可视化检测肿瘤外泌体的新型纳米杂化物探针的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)铜离子配位黑磷量子点(Cu-BPQDs)的制备：将25mg黑磷晶体加入30mL氮甲基吡咯烷酮中，加入1mol/L硝酸铜水溶液5mL，加入溶解了5mg巯基丙酸的水溶液5mL，磁力搅拌形成均质混合液；将混合液用超声波细胞粉碎仪处理2h，再用超声波清洗器水浴处理6h；将处理后的分散液转入微型磁力高压反应釜中，在N2保护下加热至120℃，连续搅拌反应12h；反应产物冷却至室温，在5000rpm转速下离心10min，取上层清液在14000rpm转速下离心15min；离心后的沉淀物用乙醇和二次蒸馏水冲洗3次，真空干燥得到羧基功能化Cu-BPQDs；
(2)Cy5内包封二氧化硅纳米球(Cy5-SiO2)的制备：将聚乙二醇氨基PEG-NH2功能化Cy5溶于无水乙醇，加入(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTS)，搅拌均匀，放置避光处；加入氨水与乙醇，搅拌均匀，加入正硅酸乙酯(TEOS)继续搅拌，再加入TEOS进行反应；反应产物经离心、乙醇洗涤和干燥后制得Cy5内包封SiO2纳米球；将其分散在APTS与醋酸的混合液中，在室温下执行搅拌反应，产物经离心、洗涤和干燥，得到表面氨基功能化Cy5-SiO2纳米球；
(3)Cy5-SiO2/Cu-BPQDs/mSiO2复合物(Complex)的制备：将N-羟基硫代琥珀酸亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)盐酸盐分散在磷酸盐水(PBS)缓冲液中，加入氨基功能化Cy5-SiO2纳米球，搅拌均匀，放置避光处；磁力搅拌下将羧基功能化Cu-BPQDs水分散液加入混合液中，搅拌反应；产物经离心、洗涤和干燥后制得Cy5-SiO2/Cu-BPQDs杂化物；将此...

【专利技术属性】
技术研发人员：金辉，姜晓文，桂日军，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37