一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种化妆品特性菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法，利用绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌四种靶标菌的特异基因保守区序列设计出适用于多重PCR的引物，用多重PCR技术一次性检测化妆品中的特定菌绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌。解决了化妆品中特定病原菌传统技术检测周期长，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低的问题，设计的引物与多重PCR体系组装成试剂盒，用于化妆品特定菌的快速检测，该检测方法特异性好，与对照相似致病菌无交叉反应，且灵敏度高，对不同剂型化妆品模拟污染样品增菌后检出限均可达到10

【技术实现步骤摘要】
一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
特定菌(Speciamicroorganism)是化妆品中不得检出的特定微生物，包括致病菌和条件致病菌。有关特定菌的确定，目前世界尚无统一规定，各国有所不同。目前，中国则按照2007年修订的《化妆品卫生规范》，该规范规定的特定菌，即不得检出的致病微生物是3种：绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和粪大肠菌群。国外的化妆品质量保证主要是按照欧盟的消费品科学委员会(SCCP)或美国食品药品监督管理局(FDA)的规定执行，其中包括沙门氏菌。而粪大肠菌群与总大肠菌群组成相同，主要组成是埃希氏菌属，而此菌属中与人类生活密切相关的就只有大肠杆菌。目前化妆品中微生物的检测手段除传统的微生物培养方法外，也应市场需求诞生了一些快速检测手段，如快速测试片技术、聚合酶链式反应技术、三磷酸腺苷生物发光检测技术、电阻抗技术、荧光光电法、微生物挥发性有机化合物检测技术等。传统微生物检测方法所需实验材料简单、价格便宜，但操作繁琐、耗时长，约4-7天。其它几项技术操作简单，快速高效，但成本高，且易受样品中杂质干扰，仅对微生物总数进行检测，无法辨别微生物的种属；PCR技术和LAMP技术也在化妆品检测中逐渐得到应用，但一个反应只能检测单个靶标病原菌。
技术实现思路
为了解决化妆品中特定病原菌传统技术检测周期长，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低的问题，设计引物与多重PCR体系组装成试剂盒，提供一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒及检测方法。本专利技术提供了一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，包括绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌四种靶标菌的特异引物、阳性质控品、阴性质控品、PCR反应混合液。进一步的，所述绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的特异引物包括扩增绿脓杆菌的特异引物ETA-F1和ETA-R1、扩增金黄色葡萄球菌的特异引物nuc-F1和nuc-R1、扩增大肠杆菌的特异引物LacZ-F1和LacZ-R1、用于扩增沙门氏菌的特异引物invA-F1和invA-R1。进一步的，所述特异引物的核苷酸序列依次为：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示的核苷酸序列。进一步的，所述PCR反应混合液包括PCR缓冲液，TaqDNA聚合酶，dNTPs。本专利技术还公布的一种利用所述试剂盒的快速检测方法，包括以下步骤：(1)不同剂型化妆品模拟污染样品DNA模板制备，包括：(a)亲水性样品：将无菌的化妆水或乳液样品在钠盐培养基中混匀，添加四种靶标菌的混合菌液，依次倍比稀释，过夜增菌，增菌液化学裂解方法制备核酸，(b)疏水性样品：取唇膏或粉底液样品加入灭菌矿物油和灭菌tween80中匀浆，添加灭菌生理盐水，充分混匀加入到钠盐培养基中得混合液，取上述混合液添加四种靶标菌的混合菌液，依次倍比稀释，过夜增菌，增菌液化学裂解方法制备核酸；(2)多重PCR反应体系配置，所述扩增体系包括PCR反应混合液5μL，四种靶标菌特异引物混合液2μL，步骤(1)提取的DNA模板1.0μL，ddH2O补足25μL。(3)采用多重PCR法进行扩增；(4)将PCR扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，将5μL所述扩增反应产物用1％琼脂糖电泳分离，根据条带有无和大小判定结果。进一步的，所述步骤(2)的多重反应体系配置每批次试验加入阳性质控品或阴性质控品代替模板做试验对照。进一步的，所述步骤(3)中多重PCR法进行扩增的扩增条件为94℃，4min；94℃30s，64℃30s，72℃45s，共32循环；最后72℃后延伸5min。进一步的，所述检测方法对不同剂型化妆品模拟污染样品增菌后检出限均可达到100cfu/mL。与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：多重PCR技术的优势在于可以同时对成组病原物进行检测，且操作和普通PCR一样简单，所以可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，具有显著地经济效益和社会效益，特别适合成组病原体的检测，在化妆品特定菌的检验方面具有极高的应用价值，本专利技术的试剂盒中化妆品特定菌的特异引物具有较高的检测灵敏度和特异性，无交叉扩增现象，且在化妆品不同剂型样本中检测均可达到个位数特定菌，满足化妆品检测标准中特定菌零检出的检测要求，属于国内首例。本专利技术提供的不同剂型化妆品增菌培养方法以及增菌培养后制备DNA的方法，可以有效缩短检测的时间，提高检测效率。同时，增菌培养后可使扩增体系中死菌的模板DNA所占比例大大降低，从而确保了对化妆品质量控制的可靠性。总之，本专利技术提供的一种化妆品特定菌多重PCR检测方法操作简单、高效、灵敏，为化妆品的质量控制提供了有效手段，可以推广应用于化妆品中特定菌的快速检测。附图说明图1是本专利技术所述模拟化妆水样品多重PCR检测灵敏度实验结果，M为DL1000DNAMarker；1为四种靶标菌等量DNA混合样品阳性质控；2-8分别为菌液浓度分别为106-100cfu/mL的四种菌混合菌液制备的DNA样品；9为不添加靶标菌的化妆水或者乳液样品空白对照；10为ddH2O阴性对照。图2是本专利技术所述模拟乳液样品多重PCR检测灵敏度实验结果，M为DL1000DNAMarker；1为四种靶标菌等量DNA混合样品阳性质控；2-8分别为菌液浓度分别为106-100cfu/mL的四种菌混合菌液制备的DNA样品；9为不添加靶标菌的化妆水或者乳液样品空白对照；10为ddH2O阴性对照。图3是本专利技术所述模拟霜膏类样品多重PCR检测灵敏度实验结果，M为DL1000DNAMarker；1为四种靶标菌等量DNA混合样品阳性质控；2-8分别为100mg灭菌唇膏按上述增菌和DNA制备方法加入浓度为106-100cfu/mL四种特定菌混合菌液制备的DNA样品；9为不加菌唇膏样品空白对照；9为ddH2O阴性对照。图4是本专利技术所述单对引物特异性验证，其中A为nuc-F1/nuc-R1单引物特异性验证结果；B为ETA-F1/ETA-R1单引物特异性验证结果；C为invA-F1/invA-R1单引物特异性验证结果；D为LacZ-F1/LacZ-R1单引物特异性验证结果。1-4为金黄色葡萄球菌ATCC26003，ATCC26113，ATCC29213和1株MRSA；5-6为2株绿脓杆菌ATCC27853，ATCC15442，7-9为沙门菌属，分别为鸡肠炎沙门菌(Salmonellaenterica，CICC21510)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium，CMCC50115)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis，ATCC13312)，9-14为大肠杆菌CMCC44102，CVCC1490，ATCC35401，CVCC1562和CVCC248。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：包括绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌四种靶标菌的特异引物、阳性质控品、阴性质控品、PCR反应混合液。/n

【技术特征摘要】
1.一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：包括绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌四种靶标菌的特异引物、阳性质控品、阴性质控品、PCR反应混合液。


2.根据权利要求1所述的一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的特异引物包括扩增绿脓杆菌的特异引物ETA-F1和ETA-R1、扩增金黄色葡萄球菌的特异引物nuc-F1和nuc-R1、扩增大肠杆菌的特异引物LacZ-F1和LacZ-R1、用于扩增沙门氏菌的特异引物invA-F1和invA-R1。


3.根据权利要求1所述的一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述特异引物的核苷酸序列依次为：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示的核苷酸序列。


4.根据权利要求1所述的一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应混合液包括PCR缓冲液，TaqDNA聚合酶，dNTPs。


5.一种利用权利要求1-4中任一项所述试剂盒的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)不同剂型化妆品模拟污染样品DNA模板制备，包括：
(a)亲水性样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞超，胡茂秀，王莎莎，
申请(专利权)人：青岛智博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37