改进的大型载体在人类细胞中传递方法的发现及应用技术

本发明专利技术涉及基因组工程方面技术领域，尤其是改进的大型载体（6‑15 kb）在人类细胞中传递方法，包括向大型载体(6‑15 kb)中添加小型(1‑3 kb)载体、通过电穿孔等量共转染小(1‑3 kb)载体和大载体(6‑15 kb)。本技术方案结构设计合理，可以克服现有方法的局限性，显著提高细胞转染效率和细胞存活率，利用小载体改善细胞转染的方法将会在临床生物医学和工业生物技术中得到广泛应用，具有很好的推广应用前景。

【技术实现步骤摘要】
改进的大型载体在人类细胞中传递方法的发现及应用
本专利技术涉及基因编辑
，尤其涉及一种新的细胞转染方法研发及其应用，尤其是改进了大型载体在人类细胞转染方法。
技术介绍
CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列，是原核生物抵抗病毒入侵而进化出来的免疫武器，来抵御病毒将自身基因整合到原核生物基因组内，从而产生了CRISPR-Cas9系统，通过该系统细菌可以精准敲除或者抑制病毒在原核生物中复制和繁殖。CRISPR-Cas9技术与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR-Cas9系统实现的在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。其中包括了可变的间隔序列和相对保守的重复序列，病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospaceradjacentmotifs-原间隔序列临近基序）。当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR-RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR-Cas9技术应运而生，从而被科学家们利用。引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。在CRISPR-Cas9技术中，我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNA（guideRNA，gRNA）和Cas9蛋白。其中，向导RNA的设计并不是随机的，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（即三碱基序列NGG，其中N可以是任意碱基而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。），而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。CRISPR-Cas9以其简单的设计、目标位点的特异性和高通量应用的可扩展性，彻底改变了生物系统的基因工程技术，颠覆了以往的基因编辑技术，它可以在体内和体外删除、增强或抑制基因表达。CRISPR-Cas9系统的组成部分(包括导向RNAs)通常编码在大型染色体外表达载体(12-19kb)上，这些载体通过转染的方法被传递到细胞中。由于体积大，这些载体很难成功的进入到细胞核中，并导致细胞死亡。标准细胞转染方法的发展集中在改进技术方面，如物理介导方法包括电穿孔法发、基因枪和显微注射等，化学方法包括磷酸钙共沉淀法，脂体转染法等，生物介导包括原生质体转染法和病毒介导转染法等。其中病毒介导的转染效率最高，细胞毒性低等特点，但当用于研究或临床应用时，会引起巨大的生物安全问题和伦理问题。我们的方法能够显著提高细胞转染效率和细胞存活率，克服现有方法的局限性，并在临床生物医学和工业生物技术中具有很好的市场应用前景。
技术实现思路
为了能更好的介绍本专利技术的创新理念和技术手段，方便他人的理解和应用，下面将对本专利技术进行详细的说明。CRISPR-Cas基因组工程是一项功能强大、用途广泛、适应性强的技术，但主要依赖于将大型载体(12-19kb)导入人类细胞，导致转染效率和细胞存活率低下。在这里，我们提出了一种改进的无毒和非病毒的传递方法，可将大型载体的转染效率提高40倍，细胞存活率提高6倍。该技术的核心是在转染混合物中加入外源性的特定大小的小质粒。优选的，我们通过电穿孔的转染方法将一个大型载体(6-15kb)转染到人的细胞中。优选的，我们向大型载体(6-15kb)的混合液中添加了适量的小型载体(1-3kb)，发现转染效率和细胞存活率显著提高(图1a-b)。优选的，我们通过电转的方式将大载体(6-15kb)和等量的小载体（1-4kb）共转染到Huh7细胞(人肝癌细胞系)，共转染效率从14.2%(图1c)提高到45.1%(图1d)，细胞死亡率从60.3%(图1c)降低至18.5%(图1d)，可以看出效果十分显著。优选的，共转染的细胞不仅仅是Huh7细胞系还包括了HepG2（肝），PC3（前列腺），MCF7（乳腺），HEK293（肾），A549（肺），神经元（SH-SY5Y）、白血病（HL-60）以及外周血单个核细胞和纯化的CD8+T细胞。优选的，共转染方法在其它难以转染和原代细胞类型中更为常用。为了能更好的介绍本专利技术的创新理念和技术手段，方便他人的理解和应用，下面将对本专利技术进行详细的说明。CRISPR-Cas基因组工程是一项功能强大、用途广泛、适应性强的技术，但主要依赖于将大型载体(12-19kb)导入人类细胞，导致转染效率和细胞存活率低下。在这里，我们提出了一种改进的无毒和非病毒的传递方法，可将大型载体的转染效率提高40倍，细胞存活率提高6倍。该技术的核心是在转染混合物中加入外源性的特定大小的小质粒。优选的，我们通过电穿孔的转染方法将一个大型载体(6-15kb)转染到人的细胞中。优选的，我们向大型载体(6-15kb)的混合液中添加了适量的小型载体(1-3kb)，发现转染效率和细胞存活率显著提高(图1a-b)。优选的，我们通过电转的方式将大载体(6-15kb)和等量的小载体（1-4kb）共转染到Huh7细胞(人肝癌细胞系)，共转染效率从14.2%(图1c)提高到45.1%(图1d)，细胞死亡率从60.3%(图1c)降低至18.5%(图1d)，可以看出效果十分显著。优选的，共转染的细胞不仅仅是Huh7细胞系还包括了HepG2（肝），PC3（前列腺），MCF7（乳腺），HEK293（肾），A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.改进的大型载体(6-15 kb)在人类细胞中传递方法，其特征在于，在转染混合物中加入特定大小的质粒，即大型载体(6-15 kb)和/或小型载体(1-3 kb)。/n

【技术特征摘要】
1.改进的大型载体(6-15kb)在人类细胞中传递方法，其特征在于，在转染混合物中加入特定大小的质粒，即大型载体(6-15kb)和/或小型载体(1-3kb)。


2.根据权利要1所述方法中，通过电穿孔等量共转染小载体(1-3kb)和大载体(6-15kb)。


3.权利要求1、2所述的方法中，小载体（1-3kb）作用在于提高转染效率和细胞存活率。...

【专利技术属性】
技术研发人员：克劳迪娅·库特，乔纳斯·内斯科乌·桑德加德，尹秀山，
申请(专利权)人：拜澳泰克沈阳生物医学集团有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21