用于靶细胞分选的核酸探针、生物芯片、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于靶细胞分选的核酸探针、生物芯片、试剂盒及方法，其中，所述核酸探针包括细胞结合单元和剪切单元，所述细胞结合单元为含有靶细胞表面标志物特异性结合序列的核酸适配体，可与所述靶细胞特异性结合，所述剪切单元含有基因编辑复合物的特异性识别序列，可被所述基因编辑复合物特异性切割。本发明专利技术所公开的核酸探针可特异性地捕获和释放生物样本中的靶细胞，尤其是CTC细胞，同时实现细胞的无损释放与分型。

【技术实现步骤摘要】
用于靶细胞分选的核酸探针、生物芯片、试剂盒及方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种用于靶细胞分选的核酸探针、生物芯片、试剂盒及方法。
技术介绍
循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell)简称CTC，通常指从原发或继发肿瘤脱落进入外周血循环的稀有肿瘤细胞。CTC循环肿瘤细胞在肿瘤病人血液中的含量极少，每1mL血液中只有1-10颗肿瘤细胞。现有CTC捕获技术能够在病人血液中捕获微量的CTC。与普通细胞相比，肿瘤细胞的物理特性(大小、密度和力学特性等)和生化特性(表面标志物蛋白)存在较大的差异，因此利用以上差异对血液中的CTC进行捕获是常用的方法。但是由于不同类型的CTC物理特性(大小、密度和力学特性等)存在差异，且处于不同类型、不同阶段的CTC表面表达的抗原也存在一定的差异，因此单一的捕获方法在捕获CTC效率和纯度方面存在局限性。为提高CTC捕获效率和纯度，越来越多的研究采取物理特性和生化特性结合进行CTC捕获。现有的CTC释放方法包括酶响应、配体杂交、化学还原反应和热响应释放等。由于CTC携带全面的DNA、RNA、蛋白质及脂类等信息，因此将CTC从芯片上释放的过程应尽量保证CTC的完整性和活性，以便进行下游的细胞培养、遗传物质检测和蛋白分析等操作。传统的CTC细胞分型技术，包括多重荧光抗体免疫染色、细胞染色和流式细胞分析等，存在着成本高、细胞活性差、样品消耗量大和无法直接进行细胞分型后分析的问题。基于微流控的CTC检测方法能够将细胞的捕获和释放集成在一张芯片上，从而在低成本、低样品消耗量的前提下实现了CTC捕获和释放。但是，现有的CTC检测微流控芯片中，CTC的释放和分型是分开进行的，且释放剂单一，灵活性差，无法实现多类型CTC随机组合释放。中国专利(CN107488576A)和美国专利(US20150260710A1)分别基于化学还原反应和热响应技术公开了CTC捕获后的无损释放方法，但释放后的CTC因为数量极少，无法直接进行后续的分型分析等操作。目前，也有基于多重荧光抗体免疫检测和限制性内切酶进行CTC捕获和分离的方法，但此类方法在进行CTC释放时需要借助荧光显微镜进行CTC的分型和计数，释放的细胞不能直接用于下游的细胞培养、遗传物质检测和蛋白分析等操作，而且单一的释放剂造成不同类型的CTC混合释放，无法使分型后的细胞分别释放，难以用于下游研究。
技术实现思路
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，本专利技术期望提供一种用于靶细胞分选的核酸探针、生物芯片、试剂盒及方法，以期实现靶细胞无损释放和分型一体化，且实现多类型靶细胞的组合释放和组合分型。作为本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种用于靶细胞分选的核酸探针，所述核酸探针包括细胞结合单元和剪切单元，其中，细胞结合单元为含有靶细胞表面标志物特异性结合序列的核酸适配体，可与靶细胞特异性结合，从而捕获靶细胞；剪切单元含有基因编辑复合物的特异性识别序列，可被所述基因编辑复合物特异性切割，从而释放细胞结合单元捕获的靶细胞。作为优选，所述基因编辑复合物选自sgRNA/Cas复合物、锌指核酸酶(ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶；更优选地，所述基因编辑复合物为sgRNA/Cas9复合物，其中sgRNA包含与所述基因编辑复合物特异性识别序列互补的序列，可引导Cas9对该序列进行靶向切割。作为优选，所述核酸探针还包括可将核酸探针连接于生物芯片的修饰基团，所述核酸探针可通过修饰基团与生物芯片上结合分子的结合固定到生物芯片上。作为优选，所述核酸探针还包括第一连接序列和第二连接序列，所述第一连接序列位于细胞结合单元与剪切单元之间，用于分隔细胞结合单元和剪切单元，避免结合过程中各蛋白质间的空间位阻；所述第二连接序列位于剪切单元和修饰基团之间。作为本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种用于靶细胞分选的生物芯片，所述用于靶细胞分选的生物芯片包括：固体支撑物，以及设置于所述固体支撑物上的本专利技术的核酸探针。作为优选，所述固体支撑物上设置有两种以上可被不同基因编辑复合物特异性切割的核酸探针，不同核酸探针可针对不同的靶细胞，具有不同的靶细胞表面标志物特异性结合序列和基因编辑复合物特异性识别序列，通过先后向生物芯片中通入不同的基因编辑复合物，可依次释放不同的靶细胞。作为优选，所述固体支撑物上包含可与核酸探针上修饰基团结合的结合分子，核酸探针通过修饰基团与结合分子的结合固定在固体支撑物上。作为本专利技术的第三方面，本专利技术提供一种包含本专利技术核酸探针的用于靶细胞分选的试剂盒。作为优选，所述试剂盒还包括释放剂和可结合所述核酸探针的生物芯片，所述释放剂中包含可特异性切割所述核酸探针的基因编辑复合物。作为本专利技术的第四方面，本专利技术提供一种用于靶细胞分选的方法，所述方法包括：(a)将生物样本与包含本专利技术核酸探针的生物芯片接触，进行靶细胞的捕获；(b)向所述生物芯片中通入释放剂，收集释放的靶细胞。所述释放剂中含有可特异性切割所述核酸探针的基因编辑复合物，可特异性切割核酸探针，释放捕获的靶细胞。作为优选，所述生物芯片包括两种以上不同的核酸探针，在所述方法的步骤(b)中先后加入含有不同基因编辑复合物的释放剂，分别收集释放的靶细胞。本专利技术的有益效果：现有的靶细胞释放方法包括酶响应、配体杂交、化学还原反应和热响应释放等，这些方法的释放剂作用位点单一，本专利技术使用基因编辑复合物，尤其是sgRNA/CAS复合物切割核酸探针释放靶细胞时，可根据实际需要灵活的设计大量不同的特异性识别和切割位点，从而实现可针对不同的靶细胞设计具有不同基因编辑复合物特异性识别序列的核酸探针。在含有多种核酸探针的生物芯片中分别通入含有不同基因编辑复合物的释放剂，可特异性切割对应的核酸探针，在实现靶细胞释放的同时进行分型。不同种类的基因编辑复合物随机使用，即可实现多种靶细胞组合无损释放和组合分型。同时，本专利技术通过基因编辑复合物对核酸探针的靶向切割，该过程对靶细胞的完整性和活性几乎没有影响，释放的靶细胞可直接用于下游的各类研究。附图说明通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为本专利技术一种实施方式的核酸探针的结构示意图；图2为本专利技术另一种实施方式的核酸探针的结构示意图；图3为本专利技术一种实施方式的生物芯片的局部剖视图；图4为本专利技术一种实施方式的生物芯片的俯视图；图5为本专利技术第一核酸探针的基因编辑复合物特异性识别序列的序列、切割位点及PAM序列示意图；图6为本专利技术第二核酸探针的基因编辑复合物特异性识别序列的序列、切割位点及PAM序列示意图；图7为本专利技术一种实施方式的第一核酸探针和第二核酸探针捕获HMC-1细胞和HepG2细胞的原理图；图8为本专利技术一种实施方式的HMC-1细胞和HepG2细胞依次无损释放和分型原理图；图9为本专利技术一种实施方式的HMC-1细胞和HepG2细胞组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于靶细胞分选的核酸探针，其特征在于，所述核酸探针包括细胞结合单元和剪切单元，/n所述细胞结合单元为含有靶细胞表面标志物特异性结合序列的核酸适配体，可与所述靶细胞特异性结合；/n所述剪切单元含有基因编辑复合物的特异性识别序列，可被所述基因编辑复合物特异性切割。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于靶细胞分选的核酸探针，其特征在于，所述核酸探针包括细胞结合单元和剪切单元，
所述细胞结合单元为含有靶细胞表面标志物特异性结合序列的核酸适配体，可与所述靶细胞特异性结合；
所述剪切单元含有基因编辑复合物的特异性识别序列，可被所述基因编辑复合物特异性切割。


2.根据权利要求1所述的核酸探针，其特征在于，所述基因编辑复合物选自sgRNA/Cas复合物、锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶；优选的，所述基因编辑复合物为sgRNA/Cas9复合物。


3.根据权利要求1所述的核酸探针，其特征在于，所述核酸探针还包括可将所述核酸探针连接于生物芯片的修饰基团。


4.根据权利要求1所述的核酸探针，其特征在于，所述核酸探针还包括第一连接序列，所述第一连接序列位于所述细胞结合单元与所述剪切单元之间。


5.根据权利要求1所述的核酸探针，其特征在于，所述靶细胞为循环肿瘤细胞。


6.一种用于靶细胞分选的生物芯片，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鸿敏，
申请(专利权)人：京东方科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11