重组抗人PD-1抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种结合程序性细胞死亡蛋白1(PD‑1)的抗体或其片段，以及所述抗体或其片段用于预防或治疗肿瘤或癌症的用途。本发明专利技术的抗体或其片段能够有效阻断PD‑1/PD‑L1、PD‑1/PD‑L2相互作用，而且具有独特的抗原结合表位，在药效和安全性上具有独特的性质。

【技术实现步骤摘要】
重组抗人PD-1抗体及其应用
本专利技术涉及抗体药物领域，具体而言，本专利技术涉及针对人PD-1的抗体及其用于制备药物的用途。
技术介绍
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，也被称为CD279，是T细胞受体CD28家族的成员，表达于多种免疫细胞，如T细胞，B细胞，单核细胞等的表面，是一种在肿瘤微环境中抑制CD4+和CD8+T细胞功能的重要的免疫检查点分子。PD-1的关键配体包括PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，它们由免疫细胞表达，并且还可以在多种组织上诱导，当T细胞上的PD-1结合PD-L1或PD-L2时，T细胞接收抑制信号，从而抑制T细胞增殖和细胞因子产生，会有效降低T细胞参与的免疫应答。而PD-L1和PD-L2在多种人类肿瘤细胞上高表达，因此使得肿瘤细胞逃避T细胞的监督(PardollDM.Theblockadeofimmunecheckpointsincancerimmunotherapy.Nat.Rev.Cancer12(4)，252-264(2012))。目前在全球范围内已上市的抗人PD-1的单抗共有3种。抗人PD-1的全人源抗体纳武单抗(Nivolumab)显示抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合，临床用于治疗晚期黑色素瘤，非小细胞肺癌，肾细胞癌，霍奇金淋巴瘤，头颈部鳞癌，尿路上皮癌，结直肠癌和肝细胞癌；抗人PD-1的人源化抗体派姆单抗(Perbrolizumab)显示抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合，临床用于治疗恶性黑色素瘤，非小细胞肺癌，经典型霍奇金淋巴瘤，头颈部鳞癌，d-mmr突变或MSI-H恶性肿瘤(Alsaabetal.PD-1andPD-L1CheckpointSignalingInhibitionforCancerImmunotherapy：Mechanism，Combinations，andClinicalOutcome.Front.Pharmacol.8：561)。抗人PD-1的Libtayo单抗(Cemiplimab)可与PD-1结合并阻断其与PD-L1和PD-L2的相互作用，释放PD-1通路介导的免疫应答抑制，包括抗肿瘤免疫应答，临床用于治疗转移性皮肤鳞状细胞癌(CSCC)患者或局部晚期CSCC患者(Markham，A.&Duggan，S.Drugs.2018.doi：10.1007/s40265-018-1012-5)。国内处于临床阶段的抗人PD-1的单抗就有10多种，适应症覆盖复发难治恶性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，B细胞非霍奇金淋巴瘤，腺泡状软组织肉瘤，晚期或复发性恶性肿瘤，食管癌、胃癌或胃食管结合部癌，鼻咽癌、头颈部鳞癌，肺癌，转移性结直肠癌，局限性肾细胞癌，尿路上皮癌，肝细胞癌，黑色素瘤，晚期三阴性乳腺癌，胸膜间皮瘤，晚期神经内分泌肿瘤，不可切除或d-mmr突变或MSI-H实体瘤。其中恒瑞的SHR-1210、百济神州的tislelizumab、信达的IBI-308已递交上市申请，君实的JS001已于12月17日有条件批准上市，名为特瑞普利单抗注射液(商品名：拓益)。国际上，抗PD-1的抗体已经有三个上市品种，多个临床在研品种。涉及的专利包括：WO2004004771，WO2006121168，WO2008156712，WO2010029435，WO2012145493，WO2015085847，US20170044260，CN104250302，CN105330740，CN105531288等。通过分析这些专利发现，可以通过杂交瘤筛选、人源化途径，或通过噬菌体展示或者酵母表面展示技术，或通过转基因小鼠技术获得抗PD-1的抗体。其中WO2015085847中获得抗人PD-1的抗体的方法为：利用杂交瘤技术获得鼠抗体，通过抗体活性分析(ELISA(结合，阻断)，亲和力动力学)获得候选鼠抗体后；将鼠抗体轻重链基因可变区序列克隆至编码人抗体轻重链恒定区序列的上游，进行哺乳动物细胞表达，制备嵌合抗体，然后通过抗体活性分析，阻断PD-1与其配体结合实验，与CD28其他家族成员结合实验，与细胞表面PD-1结合实验，体外细胞学实验确定先导抗体后；根据Germline数据库选择人源化模板，进行抗体序列人源化设计，获得的人源化抗体再次通过抗体活性分析，阻断PD-1与其配体结合实验，与CD28其他家族成员结合实验，与细胞表面PD-1结合实验，体外细胞学实验验证后；再进行人源化抗体对体内外肿瘤细胞生长抑制实验进行最后的成药性评价，最终获得亲和力和特异性保持不变的PD-1人源化抗体序列。抗体的抗原识别表位是抗体的重要特性之一。抗PD-1抗体，通过阻断PD-1与其配体PD-L1/PD-L2的结合发挥激活T细胞的作用。目前已报道的抗体虽然都能阻断PD-1与配体的相互作用，但其所针对的抗原表位却并不完全相同(TanS，ZhangH，ChaiY，etal.AnunexpectedN-terminalloopinPD-1dominatesbindingbynivolumab.NatCommun.2017；8：14369)。而抗原表位的不同，可能导致抗体在药效和安全性上具有独特的特点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，通过杂交瘤筛选和人源化技术，获得特异性结合人PD-1的高亲和力抗体，其不但能够有效阻断PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2相互作用，而且具有独特的抗原结合表位，因此在药效和安全性上具有独特的性质。针对上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种特异性结合人PD-1的抗体或其功能片段，并提供其用途。本专利技术的技术方案如下。一方面，本专利技术提供一种结合程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含轻链可变区和/或重链可变区，其中所述轻链可变区和/或重链可变区分别包含以下序列所示的轻链CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)、CDR3(LCDR3)和/或重链CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)、CDR3(HCDR3)：在本专利技术提供的抗体或其片段中，优选地，所述轻链可变区和/或重链可变区分别包含以下序列所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和/或HCDR1、HCDR2、HCDR3：在本专利技术提供的抗体或其片段中，优选地，所述轻链可变区和/或重链可变区分别包含以下序列所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和/或HCDR1、HCDR2、HCDR3：选自SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和SEQIDNO：11的LCDR1；选自SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16和SEQIDNO：17的LCDR2；选自SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22、SEQIDNO：23、SEQIDNO：24、SEQIDNO：25、SEQIDNO：26和SEQIDNO：27的LCDR3；和/或...

【技术保护点】
1.一种结合程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含轻链可变区和/或重链可变区，其中所述轻链可变区和/或重链可变区分别包含以下序列所示的轻链CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)、CDR3(LCDR3)和/或重链CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)、CDR3(HCDR3)：/n

【技术特征摘要】
1.一种结合程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含轻链可变区和/或重链可变区，其中所述轻链可变区和/或重链可变区分别包含以下序列所示的轻链CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)、CDR3(LCDR3)和/或重链CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)、CDR3(HCDR3)：





2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区和/或重链可变区分别包含以下序列所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和/或HCDR1、HCDR2、HCDR3：








3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区和/或重链可变区分别包含以下序列所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和/或HCDR1、HCDR2、HCDR3：
选自SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和SEQIDNO：11的LCDR1；
选自SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16和SEQIDNO：17的LCDR2；
选自SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22、SEQIDNO：23、SEQIDNO：24、SEQIDNO：25、SEQIDNO：26和SEQIDNO：27的LCDR3；和/或
选自SEQIDNO：28、SEQIDNO：29、SEQIDNO：30、SEQIDNO：31、SEQIDNO：32和SEQIDNO：33的HCDR1；
选自SEQIDNO：34、SEQIDNO：35、SEQIDNO：36、SEQIDNO：37、SEQIDNO：38、SEQIDNO：39、SEQIDNO：40、SEQIDNO：41、SEQIDNO：42、SEQIDNO：43、SEQIDNO：44、SEQIDNO：45和SEQIDNO：46的HCDR2；
选自SEQIDNO：47、SEQIDNO：48、SEQIDNO：49、SEQIDNO：50、SEQIDNO：51的HCDR3。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区包含以下序列组合所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3：






和/或，所述重链可变区包含以下序列组合所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3：






优选地，所述轻链可变区和重链可变区包含以下序列组合所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3：











5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段具有以下活性中的一个或多个：
(1)阻断PD-1与其配体PD-L1或PD-L2的结合；
(2)特异性结合灵长类动物PD-1，与非灵长类动物PD-1无交叉反应；
(3)不结合除PD-1之外的其他CD28家族成员；
(4)在CD4+T细胞中诱导IL-2和/或IFN-γ产生；
(5)无ADCC效应功能；
优选地，所述抗体或其片段结合人PD-1N58糖链；优选地，所述抗体或其片段的重链可变区包含SEQIDNO：47所示氨基酸序列；
优选地，所述轻链可变区包含SEQIDNO：52或SEQIDNO：60所示氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或，
所述重链可变区包含SEQIDNO：54或SEQIDNO：62所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述至少75％同一性为例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性等≥75％的任何百分比的同一性。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区包含SEQIDNO：60所示氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体，根据SEQIDNO：60所示氨基酸序列的残基编号，所述变体相对于SEQIDNO：60具有选自以下的一个或多个、优选1-3个氨基酸置换：K24R、E30S、V32A、V32Y、W50A、W50G、H55A、H55Q、T56S、Y9...

【专利技术属性】
技术研发人员：张锦超，王荣娟，焦莎莎，王双，
申请(专利权)人：迈威上海生物科技有限公司，北京科诺信诚科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31