经修饰的CAR-T制造技术

本发明专利技术涉及表达提供嵌合抗原受体(CAR)的表达的构建体的γδ(gamma delta)T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)并入了FCY受体的信号传导结构域。合适地，本发明专利技术还涉及提供这样的CAR的构建体以及用于将这样的CAR引入细胞中并且在包含γδ(gamma delta)T细胞受体和/或自然杀伤(NK)细胞受体的细胞中表达这样的CAR的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的CAR-T专利
本专利技术涉及表达提供嵌合抗原受体(CAR)的表达的构建体的γδ(gammadelta)T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)并入了Fcγ受体的信号传导结构域。合适地，本专利技术还涉及提供这样的CAR的构建体以及用于将这样的CAR引入细胞中并且在包含γδ(gammadelta)T细胞受体和/或自然杀伤(NK)细胞受体的细胞中表达这样的CAR的方法。背景免疫球蛋白(Ig)的细胞受体(Fc受体)在40年前被鉴定出，并且在免疫应答的启动和消退中发挥核心作用。这些受体设定B细胞活化的阈值，调节树突细胞的成熟，并且将抗体应答的特异性偶联至固有效应物功能，诸如吞噬作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在迄今研究过的所有哺乳动物物种中，已经鉴定出四种不同类别的识别IgG的Fc受体(FcR)，FcγRI(CD64)、FcRγRII(CD32)、FcRγIII(CD16)和FcRγIV。基于它们的功能，可以将它们细分为两类，活化性受体和抑制性受体，它们分别通过基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或抑制基序(ITIM)传递信号。FcγRIIB属于包括调节免疫应答的CTLA-4和PD-1的免疫抑制性受体家族。活化性FcγR包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIII和FcγRIV。活化性Fcγ受体的接合触发许多生物功能，诸如B细胞的增殖、巨噬细胞的吞噬作用、细胞溶解、脱粒和启动炎性应答的细胞因子编码基因的转录活化。大多数活化型FcR与包含ITAM的Fc受体共有γ链(FcRγ)缔合(FcRγ链(FcR共有γ链)与细胞因子受体使用的共有γ链(CD132)不同)。另一方面，活化性受体CD32a和CD32c具有包含细胞内ITAM的结构域。配体结合后Fc受体的聚集导致ITAM磷酸化和细胞活化。免疫细胞诸如γδT细胞和NK细胞表达Fcγ受体，所述Fcγ受体介导它们的至少一部分功能。这些细胞是固有免疫系统的一部分，并且对于针对癌症和感染的免疫是不可或缺的。它们利用许多受体来识别并且杀死被感染的细胞和癌性细胞。它们介导它们的细胞毒性活性的方式之一是通过Fcγ受体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。这是一种免疫机制，免疫系统的效应细胞藉此主动裂解靶细胞，所述靶细胞上的膜表面抗原已经被特异性抗体结合。γδT细胞和NK细胞表达介导ADCC的Fcy受体CD32和CD16。这两种细胞类型都已经作为针对多种类型的癌症(例如黑素瘤、肾细胞癌等)的细胞疗法进行试验，显示出安全性和治疗潜力。体外研究已经证明，这些细胞的效应物功能可以被单克隆抗体增强，这可能是由于由表达的FcR启动的活化信号。这导致提出这些细胞疗法应与单克隆抗体疗法例如靶向HER2受体的曲妥珠单抗组合。通过这种方式，这些细胞的活性将集中于被抗体结合的细胞(Tokuyama等人,InternationaljournalofCancer,2011,Vγ9Vδ2Tcellcytotoxicityagainsttumorcellsisenhancedbymonoclonalantibodydrugs—Rituximabandtrastuzumab和Gertner-Dardenne等人,Blood,2009,Bromohydrinpyrophosphateenhancesantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicityinducedbytherapeuticantibodies)。嵌合抗原受体(CAR)使免疫系统的活性重定向并且靶向针对特定的靶的非常有效的方式是通过在免疫系统的细胞上表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR是模块蛋白，所述CAR将单克隆抗体(mAb)的特异性移植到免疫细胞的效应物功能上。它们通常的形式是具有与信号传导胞内结构域(endodomain)相连的抗原识别氨基末端、间隔区和跨膜结构域的I型跨膜结构域蛋白的形式，所述信号传导胞内结构域传递存活和活化信号。CAR可以是来源于识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)经由间隔区和跨膜结构域与信号传导胞内结构域融合的融合体。最初，它们被开发以使αβT细胞的免疫功能重定向针对表达被靶向的抗原的癌细胞。这是由于，因癌症特异性αβT细胞克隆在外周血或活组织检查物中罕见，而无法鉴定和扩增所述癌症特异性αβT细胞克隆以用于在临床试验中使用。在这样的CAR中使用的信号传导结构域的选择反映了αβT细胞中的CAR的开发。大多数CAR通常包含来自CD3ζ(zeta)链的信号传导结构域以及来自CD28或CD137的结构域，所述来自CD3ζ(zeta)链的信号传导结构域提供T细胞受体样(信号1)刺激，所述来自CD28或CD137的结构域提供共刺激(信号2)。在CAR识别靶抗原后，继而发生T细胞活化，其导致对表达抗原的细胞的直接细胞毒性。尽管在使用表达CAR的αβT细胞的试验中报告了令人印象深刻的应答，但这些应答常常伴随着严重的不良事件，诸如细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性以及许多情况下的死亡。这在一定程度上归因于T细胞通过CAR的不受控的活化以及对表达抗原的健康细胞的靶向，这被称为靶向非肿瘤毒性(on-target,off-tumourtoxicity)。另外，由于抗原依赖性或非依赖性的CAR活化，这些αβT细胞的持续活化会导致耗竭和降低的生物活性。专利技术概述对于具有更高选择性和降低的靶向非肿瘤毒性的可选的基于CAR的方法存在需求。已经报道了使用固有细胞诸如γδT细胞和NK细胞作为CAR的载体。然而，这些研究使用了与αβTCAR具有相似信号传导结构域的CAR，例如CD3ζ和CD28或CD137，这导致了类似的问题，诸如靶向非肿瘤毒性。与αβT细胞不同，γδT细胞和NK细胞的效应物功能与分子诸如FcγR相关。本专利技术人已经确定，表达包含Fcγ受体共有链的刺激性结构域的CAR的γδT细胞或NK细胞将导致增加的效应物功能(例如细胞毒性、细胞因子产生、抗原获取和呈递)，这可以在细胞疗法的开发中被利用。因此，本专利技术人开发了CAR构建体，该CAR构建体在抗原与CAR的细胞外部分结合时刺激来源于Fcγ受体的细胞内信号传导结构域，这引起通常与Fcγ受体相关的信号传导途径的活化。认为表达编码嵌合抗原受体(CAR)的构建体的γδT细胞或NK细胞或者表达与γδT细胞或NK细胞相关的T细胞受体、还表达编码嵌合抗原受体(CAR)的构建体的细胞可以能够识别靶细胞，并且当与靶细胞结合时，以类似于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方式引起细胞死亡，所述嵌合抗原受体(CAR)并入了一个或更多个Fcγ受体的信号传导结构域，所述信号传导结构域包括但不限于Fc受体γ链、CD32a、CD32c或CD64的信号传导结构域、或其功能变体和片段及其组合。表达构建体的γδT细胞或NK细胞可以具有增加的效应物功能，诸如增加的炎性细胞因子产生、抗原获取和呈递或活化适应性免疫应答的能力。合适地，提供了表达编码嵌合抗原受体(CAR)的构建体的γδT细胞或NK细胞或者表达与γδT细胞或NK细胞相关的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.γδT细胞或自然杀伤细胞，所述γδT细胞或自然杀伤细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含/n(i)与跨膜结构域偶联的抗原结合结构域，/n(ii)细胞内活化信号传导结构域，/n其中所述细胞内信号传导结构域包含一个或更多个Fcy受体细胞内信号传导结构域，使得抗原与CAR的抗原结合结构域的结合引起通过所述CAR的细胞内信号传导结构域的信号传导。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170929 GB 1715918.71.γδT细胞或自然杀伤细胞，所述γδT细胞或自然杀伤细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含
(i)与跨膜结构域偶联的抗原结合结构域，
(ii)细胞内活化信号传导结构域，
其中所述细胞内信号传导结构域包含一个或更多个Fcy受体细胞内信号传导结构域，使得抗原与CAR的抗原结合结构域的结合引起通过所述CAR的细胞内信号传导结构域的信号传导。


2.根据权利要求1所述的γδT细胞或自然杀伤细胞，其中所述Fcy受体细胞内信号传导结构域选自FcR共有γ链，CD16受体或CD32a或CD32c或CD64中的至少一种的信号传导结构域或其功能变体。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的γδT细胞，其中通过所述γδT细胞的γδT细胞受体与所述γδT细胞受体对其具有结合特异性的靶配体的结合引起第一细胞内信号，并且CAR抗原结合结构域与所述CAR对其具有结合特异性的靶配体的结合引起第二细胞内信号，其中所述第一细胞内信号和所述第二细胞内信号单独地或以组合方式引起所述γδT细胞的活化。


4.根据权利要求1或权利要求2所述的自然杀伤(NK)细胞，其中通过所述NK细胞的NK细胞受体与所述NK细胞受体对其具有结合特异性的靶配体的结合引起第一细胞内信号，并且CAR抗原结合结构域与所述CAR对其具有结合特异性的靶配体的结合引起第二细胞内信号，其中所述第一细胞内信号和所述第二细胞内信号单独地或以组合方式引起所述NK细胞的活化。


5.根据权利要求3所述的γδT细胞或根据权利要求4所述的自然杀伤细胞，其中活化引起所述γδT细胞或自然杀伤细胞具有至少一种增加的效应物功能，所述效应物功能选自细胞毒性、细胞因子产生、抗原获取或抗原呈递。


6.根据权利要求3所述的γδT细胞或根据权利要求4所述的自然杀伤细胞，其中靶细胞对所述γδT细胞或自然杀伤细胞的活化引起所述γδT细胞或所述自然杀伤细胞的活化以促进所述靶细胞的细胞死亡。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的γδT细胞或自然杀伤细胞，所述γδT细胞或自然杀伤细胞包含编码CAR的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3中的至少一种或其组合。


8.根据权利要求1至6中任一项所述的γδT细胞或自然杀伤细胞，所述γδT细胞或自然杀伤细胞包含编码CAR的核酸构建体，所述CAR选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7中的至少一种或其组合。


9.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)与跨膜结构域偶联的抗原结合结构域，
(ii)细胞内活化信号传导结构域，
其中细胞内细胞信号传导结构域包含一个或更多个Fcy受体信号传导结构域，使得抗原与CAR的抗原结合结构域的结合引起通过所述CAR的细胞内信号传导结构域的信号传导，所述Fcy受体信号传导结构域选自CD32a或CD32c或CD64的信号传导结构域或这样的信号传导结构域的功能变体。


10.根据权利要求9所述的核酸构建体，其中所述细胞内细胞信号传导结构域由一个或更多个Fcy细胞内信号传导结构域组成，使得抗原与CAR的抗原结合结构域的结合引起通过所述CAR的细胞内信号传导结构域的信号传导，所述Fcy细胞内信号传导结构域...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿加皮托斯·帕塔卡斯，蒂莫西·罗恩登，埃米利奥·科西莫，
申请(专利权)人：特希生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB