基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法技术

本发明专利技术公开一种基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法，属于生物技术、免疫分析和纳米材料应用领域。本发明专利技术构建了荧光标记多肽与纳米氧化石墨烯基于FRET的荧光传感器，将其加入杂交瘤细胞中，实现了高亲和力单克隆抗体分泌细胞的筛选。此方法只需要一步就可以筛选出高亲和力单克隆抗体分泌细胞，简化了传统筛选方法的复杂过程，具有方便快速、节约人力、物力、财力的优点。

【技术实现步骤摘要】
基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法
本专利技术属于生物技术和免疫分析领域，特别涉及一种基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法。
技术介绍
2004年，纳米石墨烯片层被首次分离出来，并由于其独特的结构和优异的性能成为国内外学者的研究热点。纳米氧化石墨烯(Nanographeneoxide，NGO)是纳米石墨烯材料经过强氧化后再分解而得，其表面含有含氧基团如羟基、烷氧基、羧基等，这些活性基团的存在使NGO在水溶液中的分散稳定性显著提高，并使其具有亲水性和生物相容性，可与多种生物分子相互作用。除此之外，最让人关注的是纳米氧化石墨烯高效的能量吸收和贮藏功能。荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)是一项成熟灵敏的分子相互作用监测技术，是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具。FRET是相互接近的两个荧光分子间产生能量转移的一种现象，当一个荧光基团(供体Donor)的发射光谱与另一个基团(受体Acceptor)的吸收光谱有一定重叠，在两者合适的距离下就可以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。纳米氧化石墨烯对能量具有高效的转移和吸收作用，当NGO与荧光分子相互靠近到纳米级间距时，将劫取荧光能量，发生快速荧光萃灭效应，而当NGO与荧光分子解离，则不发生荧光能量转移效应，荧光即可重现。因此，NGO可作为一种灵敏的荧光传感器材料，用于设计和构建基于FRET的检测技术体系。目前，单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)在生物制药、免疫分析和生物制备中已得到广泛应用。杂交瘤技术仍然是生产制备mAb的主流方法，其基本步骤包括：1)用特定的抗原免疫动物；2)动物B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合；3)分泌单克隆抗体杂交瘤细胞筛选；4)抗体分泌细胞克隆化；5)mAb特性鉴定。其中，细胞筛选与克隆化是制备理想mAb的关键环节。即传统的单克隆抗体细胞筛选方法过程比较繁琐，有两次筛选过程，第一次是使用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；第二次就是进一步筛选出能产生我们需要的抗原特异性抗体的杂交瘤细胞。但是大量杂交瘤细胞样品需要在短时间内确认是否为抗体分泌细胞，并且要鉴定高亲和力抗体分泌细胞，以决定杂交瘤细胞的取舍。因此，必须建立方便快速和廉价的高亲和力单克隆抗体分泌细胞的筛选方法。当前，酶联免疫分析(ELISA)、单细胞显微分析和荧光细胞分选(FACS)等方法相继建立，但仍未能尽如人意，高亲和力单克隆抗体分泌细胞筛选方法一直是获得高亲和力mAb的技术瓶颈。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法，包括如下步骤：(1)将纳米氧化石墨烯(NGO)与荧光标记抗原(FAg)混合，超滤，得到NGO-FAg荧光传感器；(2)将单克隆抗体杂交瘤细胞与步骤(2)的NGO-FAg荧光传感器混合，分选强荧光细胞，即筛选出高亲和力单克隆抗体分泌细胞。步骤(1)中所述的荧光标记抗原是通过将异硫氰酸荧光素(FITC)标记在免疫抗原(Ag)的多肽N端得到。所述的免疫抗原优选为硒蛋白K特定的抗原表位肽，其氨基酸序列为：MVYISNGQVLDSRNQSPWRV，分子量为2852Da。所述的异硫氰酸荧光素的激发光波长为488nm，发射光波长为520nm。步骤(1)中所述的NGO的片径大小为50～200nm，比表面积为50～100m2/g；优选片径大小为86nm，比表面积为90m2/g。步骤(1)中所述的NGO在体系中的浓度为1.0～1.5μg/mL；优选为1.25μg/mL。步骤(1)中所述的FAg在体系中的浓度为80～120nM；优选为100nM。步骤(1)中所述的FAg的丰度与NGO的表面积之比为1×107～8×107/μm2；优选为2.3×107/μm2。步骤(1)中所述的混合是采用浓度为0.01M、pH＝7.4的1×PBS缓冲液混合1～5min。步骤(1)中所述的超滤采用的超滤离心管为4mL、截留分子5～10KD的millipore超滤离心管。步骤(1)中所述的超滤的步骤为：采用1×PBS缓冲液(0.01M、pH＝7.4)离心3次，每次3mL，收集滤液并调整终体积至1mL。所述的离心为4℃条件下4000rpm离心10min。步骤(2)中所述的单克隆抗体杂交瘤细胞优选为以硒蛋白K特定的抗原表位肽进行动物免疫得到的SelK单克隆抗体杂交瘤细胞。步骤(2)中所述的单克隆抗体杂交瘤细胞与NGO-FAg荧光传感器混合的时间为5～20min；优选为10min。步骤(2)中所述的单克隆抗体杂交瘤细胞先经过复苏培养，扩增达到106个后，再与NGO-FAg荧光传感器混合。步骤(2)中所述的分选强荧光细胞为采用分选型流式细胞仪进行细胞分选。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及效果：1.本专利技术利用纳米氧化石墨烯与荧光标记抗原多肽制备基于FRET的荧光传感器，将其加入杂交瘤细胞中，通过细胞分泌的高亲和力mAb抢夺Ag，导致FAg与NGO产生空间位阻或解离，从而荧光重现(图1)。因此，根据细胞荧光信号强弱可区分和筛选高亲和力抗体分泌细胞。本专利技术的方法只需要一步就可以筛选出高亲和力单克隆抗体分泌细胞，可以简化传统筛选方法的复杂过程，具有方便快速、节约人力、物力、财力的优点。附图说明图1是本专利技术的原理示意图。图2是实施例1中，不同浓度NGO对FAg荧光猝灭效应检测结果图；其中，A为荧光光谱图；B为荧光强度曲线图；C为加入SelKmAb后荧光恢复结果图；D为NGO对FAg荧光猝灭动力学曲线图。图3是实施例1中，pH和温度对NGO-FAg的影响结果图；其中，A为pH对NGO-FAg的影响；B为温度对NGO-FAg的影响结果图。图4是实施例2中，NGO-FAg在不同效价SelKmAb条件下的荧光恢复强度检测结果图；其中，A为荧光光谱图；B为相对荧光强度对SelKmAb效价的线性拟合图；C为检测SelKmAb标准曲线图。图5是实施例2中，加入不同效价SelKmAb与NGO-FAg共聚物的荧光强度变化检测结果图。图6是实施例2的SelKmAb特异选择性分析结果图。图7是实施例3的共聚焦激光荧光图；其中，A为HAW-1细胞+FAg；B为RPMI-8226细胞+FAg；C为HAW-1细胞+FAg+NGO；D为RPMI-8226细胞+FAg+NGO；E为HAW-1细胞+Free-Ag+Fag。图8是实施例3的流式细胞图。图9是实施例4的流式细胞分选及抗体效价亲和力检测结果图；其中，A为流式细胞分选图，a和b为强荧光细胞，c和d为弱荧光细胞，e和f为无荧光细胞；B为间接ELISA方法检测不同时间的抗体效价结果图；C为WesternBl本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)将纳米氧化石墨烯与荧光标记抗原混合，超滤，得到NGO-FAg荧光传感器；/n(2)将单克隆抗体杂交瘤细胞与步骤(2)的NGO-FAg荧光传感器混合，分选强荧光细胞，即筛选出高亲和力单克隆抗体分泌细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将纳米氧化石墨烯与荧光标记抗原混合，超滤，得到NGO-FAg荧光传感器；
(2)将单克隆抗体杂交瘤细胞与步骤(2)的NGO-FAg荧光传感器混合，分选强荧光细胞，即筛选出高亲和力单克隆抗体分泌细胞。


2.根据权利要求1所述的基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的荧光标记抗原是通过将异硫氰酸荧光素标记在免疫抗原的多肽N端得到；
步骤(1)中所述的纳米氧化石墨烯的片径大小为50～200nm，比表面积为50～100m2/g。


3.根据权利要求2所述的基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法，其特征在于：
所述的免疫抗原为硒蛋白K特定的抗原表位肽，其氨基酸序列为：MVYISNGQVLDSRNQSPWRV，分子量为2852Da；
所述的异硫氰酸荧光素的激发光波长为488nm，发射光波长为520nm；
步骤(1)中所述的纳米氧化石墨烯的片径大小为86nm，比表面积为90m2/g；
步骤(2)中所述的单克隆抗体杂交瘤细胞为以硒蛋白K特定的抗原表位肽进行动物免疫得到的SelK单克隆抗体杂交瘤细胞。


4.根据权利要求1所述的基于荧光传感器的单克隆抗体分泌细胞筛选方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的纳米氧化石墨烯在体系中的浓度为1.0～1.5μg/mL；
步骤(1)中所述的荧光标记抗原在体系中的浓度为80～120nM；
步骤(1)中所述的荧光标记抗原的丰度与荧光标记抗原的表面积之比为1×107～8×107/μm2。

【专利技术属性】
技术研发人员：黄峙，邢曦雯，段丽青，凌钦婕，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44