本发明专利技术涉及一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用，所述的试剂盒包含：CHO DNA Control，DNA Dilution Buffer，2x MaxDetect qPCR Mix，10x CHO Detection Mix；本发明专利技术还涉及上述试剂盒的用途和使用方法。试剂盒中包含制备标准曲线的DNA参考品CHO DNA Control，已溯源至国家标准品，利用Taqman探针定量PCR方法，能快速、特异地检测fg水平的CHO宿主细胞的DNA残留。本试剂盒适用于生物制药的中间产物到最终成品的不同样本类型，检测结果准确可靠，精密度高，可检测浓度范围为0.3ng/μL‑3fg/μL。
【技术实现步骤摘要】
一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体地说，是一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用。
技术介绍
TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3’端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。TaqMan探针法的开发通过引入基于TaqDNA聚合酶5’-3’外切酶活性的荧光标记探针，实时定量PCR系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用，使得实时定量的方法得到了发展，实现了仅对特定扩增产物的检测，避免了普通荧光定量PCR染料会结合引物二聚体或非特异性扩增产物的假阳性。此外，荧光标记探针的开发，也免去了用于探针降解分析的PCR反应后处理过程。TaqMan探针法的工作原理TaqMan试剂通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。工作原理是：1.构建一段寡核苷酸探针：5’端标记荧光染料报告基团，3’端标记淬灭染料基团。当探针保持完整时，淬灭基团的靠近会通过空间上的荧光共振能力转移(FRET)而显著降低由报告染料基团发射的荧光。2.如果存在目标序列，探针便会在其中一个引物结合位点的下游发生退火，并随着引物的延伸通过TaqDNA聚合酶的5’-3’外切酶活性，完成切除。3.探针的切除会：将报告染料基团和淬灭染料基团进行分离，增强报告染料基团的信号。将探针从目的链上去除，使引物继续沿模板链末端延伸。因此，探针的介入并不会抑制整个PCR过程。4.每经过一个循环，就会有更多的报告基团染料分子从各自的探针上切断，荧光强度会随着合成的扩增片段数量的增加而增加。TaqMan探针法的优缺点TaqMan方法的优点如下：需要在探针和目标分子(靶点)之间发生特异性的水解(杂交)，方可生成荧光信号可使用明显不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测两个不同的序列，无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。TaqMan方法的主要缺点在于需要根据不同的序列，合成不同的探针。使用TaqMan探针法的检测类型用于RNA定量的一步法RT-PCR；用于RNA定量的两步法RT-PCR；DNA/cDNA定量；等位基因检测；通过IPC进行的正负检测。TaqMan探针法的应用TaqMan探针法荧光定量PCR适用于病原体检测，宿主核酸残留检测，疾病耐药基因研究，药物疗效考核，遗传疾病的诊断。新型的TaqMan-MGB探针还用于分析基因突变(SNP)，有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。由上可知，TaqMan探针法特异性好，准确度高，是一种极其灵敏的核酸检测方法。随着生物制药行业的蓬勃发展，为提高行业生产工艺的标准，TaqMan探针法荧光定量PCR被广泛的应用于CHO宿主细胞DNA残留的检测，加之进口试剂盒价格昂贵，国产试剂盒容易污染的现状，急需一款检测精度高，外源无干扰的试剂盒。基于此，我们研发了这款TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒，能快速、特异、精确地检测低至fg水平的CHO宿主细胞的DNA残留，较国内同款产品有无外源干扰，精密度更高的优势。关于本专利技术一种TaqMan探针法的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒及其应用目前还未有相关报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的引物对。本专利技术的第二个目的是针对现有技术的不足，提供一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的反应体系。本专利技术的第三个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述反应体系的用途。本专利技术的第四个目的是针对现有技术的不足，提供一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的方法。本专利技术的第五个目的是针对现有技术的不足，提供一种TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒。本专利技术的第六个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述试剂盒的使用方法。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的引物对，其特征在于，所述引物对为senseprimer:5’-GACAGGGTTTCTCTGTGTAG-3’(SEQIDNO:1)所示的正向引物和antiprimer:5’-CAGCACTCGGGAGGCAGA-3’(SEQIDNO:2)所示的反向引物。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的反应体系，所述的反应体系为实时荧光定量PCR反应体系，包含权SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物对和probe:5’-CTTTGGAGCCTATCCTG-3’(5'-FAM，3'-BHQ1)(SEQIDNO:3)所示的探针。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：如上所述的反应体系在制备CHO宿主细胞DNA残留检测的试剂盒中的应用。优选地，所述的CHO宿主细胞DNA残留检测是适用于但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。优选地，所述的CHO宿主细胞DNA残留检测是适用于以CHO为宿主细胞的生物制药工艺的中间产物到最终成品的不同样本类型。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的方法，所述的方法为：使用上述反应体系对待测样本提取DNA后进行实时荧光定量PCR，根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。优选地，所述的待测样本可为但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。优选地，所述的待测样本是以CHO为宿主细胞的生物制药工艺的中间产物到最终成品的不同样本类型。为实现上述第五个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒，所述的试剂盒包含CHODNAControl，DNADilutionBuffer，2xMaxDetectqPCRMix，10xCHODetectionMix；所述的DNADilutionBuffer中含有NaN3；所述的10xCHODetectionMix中含有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物对和SEQIDNO:3所示的探针。优选地，所述的CHODNAControl浓度为30ng/μL，可溯源至国家标准品。为实现上述第六个目的，本专利技术采取的技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ IDNO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的引物对，其特征在于，所述引物对为SEQIDNO:1所示的正向引物和SEQIDNO:2所示的反向引物。
2.一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的反应体系，其特征在于，所述的反应体系为实时荧光定量PCR反应体系，包含权利要求1所述的引物对和SEQIDNO:3所示的探针。
3.权利要求2所述的反应体系在制备CHO宿主细胞DNA残留检测的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的CHO宿主细胞DNA残留检测是适用于但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。
5.一种用于检测CHO宿主细胞DNA残留的方法，其特征在于，所述的方法为：使用权利要求2所述的反应体系对待测样本提取DNA后进行实时荧光定量PCR，根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的待测样本可为但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。
7.一种TaqMan探针法的CHO宿主DNA残留检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含CHODNAControl，DNADilutionBuffer，2xMaxDetectqPCRMix，10xCHODetectionMix；所述的DNADil...
【专利技术属性】
技术研发人员：习杨，陈旭，陈刚，Y·建国，
申请(专利权)人：依科赛生物科技太仓有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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