银杏黄酮化合物生物合成基因中多个亚型的研究制造技术

本发明专利技术通过建立和分析银杏的转录组，发现了5个可能的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、2个可能的肉桂酸4‑羟化酶(C4H)、3个可能的香豆酰CoA连接酶(4CL)以及1个可能的查耳酮合成酶‑CHS。通过在酵母中异源表达并结合底物饲喂，表征了GbPAL2、GbPAL3、GbC4H1、GbC4H2、Gb4CL1和GbCHS的功能。Gb4CL1和Gb4CL3分别与GbCHS存在互作；GbC4H1和GbC4H2与其下游的Gb4CL1和Gb4CL3以及上游的GbPAL2和GbPAL3都存在互作，表明这些酶可能参与了黄酮的生物合成。进化树分析结果显示：GbPAL2和GbPAL3同属一个clade而远离其它PAL亚型；Gb4CL1和Gb4CL3同属一个分支而远离Gb4CL2。这结果进一步说明GbPAL2和GbPAL3同属黄酮生物合成路径，并且Gb4CL1和Gb4CL3也同属黄酮生物合成路径。以上结果为准确揭示银杏中黄酮的生物合成途径奠定了重要基础，为有效调控黄酮的含量提供重要依据。

【技术实现步骤摘要】
银杏黄酮化合物生物合成基因中多个亚型的研究
本专利技术属植物基因资源和医药
，涉及在银杏(Ginkgobiloba)中位于黄酮化合物有生物合成上游途径的多个基因亚型，揭示黄酮生物合成相关的多个亚型，为有效调控黄酮类化合物含量提供科学依据。
技术介绍
银杏叶提取物具有抗氧化、抗衰老、清除自由基并提高免疫力的作用；它对冠心病、心绞痛、脑动脉硬化具有明显的改善作用，且广泛用于阿尔茨海默病和高血压的治疗。标准化的银杏叶提取物的主要成分为24％的黄酮类化合物和6％的萜内酯成分。黄酮类化合物是银杏提取物中含量最高，药效活性最强的成分。本专利技术基于专利技术人已经建立的银杏细胞悬浮体系，对银杏黄酮类化合物生物合成途径进行探究，挖掘参与黄酮类化合物生物合成基因。本专利技术通过对不同亚型的基因及其编码的蛋白进行功能表征、同源分析以及亚细胞定位等分析，从而确定在不同亚型中真正参与黄酮类生物合成途径相关的基因，并阐明此类基因是否真正与黄酮类化合物的生物合成途径相关。
技术实现思路
一、
技术实现思路
本专利技术利用银杏幼苗，对银杏转录组进行高通量测序，以及黄酮类化合物生物合成的数据库，多序列比对，进行基因挖掘。成功找到黄酮类生物合成相关的候选基因，其中包括基因GbPAL、GbC4H、Gb4CL和GbCHS。使用BLAST软件将转录组测序序列与Swiss-Prot、GeneOntology、ClusterofOrthologousGroups、eukaryoticOrthologousGroups和KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes数据库比对，获得转录组序列的功能注释。通过以上方式，寻找到候选基因GbPAL2、GbPAL3、GbPAL4、GbPAL5、GbC4H2、Gb4CL1、Gb4CL2及GbCHS。然后，结合MedicinalPlantGenomicsResearch数据库和NCBI中已报道的基因，利用BLAST比对，获得候选基因GbPAL1、GbC4H1和Gb4CL3。基因序列见附录1。每个基因分别带有SacI和EcoRI酶切位点的两对引物进行扩增GbPAL、GbC4H和Gb4CL基因，分别带有NheI和BamHI酶切位点的两对引物进行扩增GbCHS，扩增产物通过电泳纯化并连接平末端克隆载体pEASY-blunt(全式金)进行DNA测序。本专利技术通过投入底物L-苯丙氨酸，对GbPAL进行功能验证，并检测到产物反式-肉桂酸。比对产物与标准品的紫外吸收光谱图及LC-MS的进一步验证，确认GbPAL2和GbPAL3具有苯丙氨酸解氨酶的生化功能(见图1，2)。反式肉桂酸的分子量为148，ESI阳离子扫描的质谱中可以检测到m/z187为[M+K]，m/z149为[M+H]，m/z131为[M-COOH]的特征峰。通过投入底物反式肉桂酸，利用HPLC-DAD检测到产物，与标准品进行比对确证为对香豆酸。利用LC-MS检测Gb4CL1与GbCHS共表达产物，在ESI阳离子模式和阴离子模式扫描的离子流图中均检测到柚皮素查耳酮和柚皮素(图3、4)。其分子量均为272，在阳离子扫描模式对应的质谱中，找到其特征峰：m/z273为[M+H]峰；m/z295为[M+Na]峰；m/z567为[2M+Na]峰以及特征碎片峰m/z153。本专利技术的亚细胞实验结果(图5、6)揭示了GbPAL，GbC4H，Gb4CL及GbCHS四个酶在细胞中的位置，其合成场所在内质网。黄酮类化合物生物合成的酶被定位在内质网的胞质一侧，它们以紧密结合在内质网上的细胞P450酶如C4H、F3’H和F3’5’H为中心，形成了多酶复合体。亚细胞实验结果进一步证明了前人的推测，即细胞色素P450酶(如C4H)起到了定位于内质网的作用，而其它酶通过相互作用与细胞色素P450酶形成多酶复合体，以此发挥合成黄酮类化合物的功能。本专利技术以GbCHS为起点，通过GbCHS与Gb4CL的组合，获得与GbCHS蛋白间相互作用(图7)，且最有可能参与黄酮类生物合成途径的Gb4CL1、Gb4CL3。然后，将GbC4H分别与Gb4CL的组合，GbC4H1、GbC4H2均与Gb4CL1、Gb4CL3蛋白间有相互作用。GbPAL2与GbC4H2蛋白间存在相互作用。GbPAL3与GbC4H1、GbC4H2蛋白结合后均有YFP荧光的生成。据此推断GbPAL2、GbPAL3、GbC4H1、GbC4H2、Gb4CL1和Gb4CL3是最有可能参与黄酮类化合物生物合成的候选基因。本专利技术利用进化树分析尚发现，五个不同亚型均分散在裸子植物和蕨类植物之间，但位于不同的分支中，差异较大(图8、9)，推测五个不同亚型的PAL参与不同的次生代谢产物生物合成途径。其中GbPAL2、GbPAL3与被子植物中的PAL亲缘关系最近，GbPAL1与GbPAL5之间的相似性更高。五个亚型的PAL都与相应的裸子植物相近，且与蕨类植物有较近的亲缘性。从进化树分析还可看出，只有GbPAL2和GbPAL3真正参与黄酮生物合成的途径。4CL分为两类大的进化分支：ClassI和ClassII。拟南芥、白杨和大豆中的ClassII普遍与黄酮的生物合成相关，而ClassI中的4CL更可能与木质素和其他苯丙素化合物的生物合成相关。Li等在研究拟南芥中不同亚型4CL的作用时，发现只有拟南芥4CL3(A.thaliana4CL3)的突变体中，黄酮的含量减少了。这说明4CL3是真正参与黄酮的生物合成途径。4CL1和4CL2的突变体中，黄酮的含量没有减少的直接变化。从而，4CL1与4CL2更多的是参与木质素等其他化合物的生物合成。Chen等过表达火炬松Pinustaeda中的4CL3，黄酮的衍生化合物-单宁含量上升，而木质素没有影响，从而推测火炬松中的4CL3也是直接参与黄酮类生物合成途径的酶。根据我们构建的进化树分析候选的Gb4CL1、Gb4CL2和Gb4CL3的功能，Gb4CL2为单独的分支，相关性较低。Gb4CL1与Gb4CL3均与火炬松4CL3，拟南芥4CL3有很高的相似性。这说明Gb4CL1与Gb4CL3非常有可能直接参与黄酮的生物合成，属于ClassII。二、附图说明图1.表达GbPAL2的酵母与L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)共发酵产物HPLC和MS图谱图2.表达GbPAL3的酵母与L-苯丙氨酸共发酵产物HPLC和MS图谱图3.表达GbC4H1和GbC4H2的酵母与反式肉桂酸(trans-cinnamicacid)共发酵产物HPLC图谱图4.Gb4CL1与GbCHS在酵母中的共表达产物柚皮素查耳酮(1，naringeninchalcone)及柚皮素，2，naringenin)a.选择性离子流图(阳离子模式,m/z273)；b.对应a图中化合物1的质谱；c.对应a图中产化合物2的质谱；图5.亚细胞定位结果图a.亚细胞定位的载体构建示意图b.绿色通道为GFP荧光，红色通道为叶绿体的自发荧光，Merged是GFP荧光与叶绿体自发荧光的组合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.银杏中11个与黄酮生物合成相关的候选基因序列，具体为：/n一种编码苯丙氨酸解氨酶GbPAL1的核苷序列，其核苷序列为SEQ ID NO.1；/n一种编码苯丙氨酸解氨酶GbPAL2的核苷序列，其核苷序列为SEQ ID NO.2；/n一种编码苯丙氨酸解氨酶GbPAL3的核苷序列，其核苷序列为SEQ ID NO.3；/n一种编码苯丙氨酸解氨酶GbPAL4的核苷序列，其核苷序列为SEQ ID NO.4；/n一种编码苯丙氨酸解氨酶GbPAL5的核苷序列，其核苷序列为SEQ ID NO.5；/n一种编码肉桂酸4-羟化酶GbC4H1的核苷序列，其核苷序列为SEQ ID NO.6；/n一种编码肉桂酸4-羟化酶GbC4H2的核苷序列，其核苷序列为SEQ ID NO.7；/n一种编码香豆酰CoA连接酶Gb4CL1的核苷序列，其核苷序列为SEQ ID NO.8；/n一种编码香豆酰CoA连接酶Gb4CL2的核苷序列，其核苷序列为SEQ ID NO.9；/n一种编码香豆酰CoA连接酶Gb4CL3的核苷序列，其核苷序列为SEQ ID NO.10；/n一种编码查耳酮合成酶GbCHS的核苷序列，其核苷序列为SEQ ID NO.11。/n...

【技术特征摘要】
1.银杏中11个与黄酮生物合成相关的候选基因序列，具体为：
一种编码苯丙氨酸解氨酶GbPAL1的核苷序列，其核苷序列为SEQIDNO.1；
一种编码苯丙氨酸解氨酶GbPAL2的核苷序列，其核苷序列为SEQIDNO.2；
一种编码苯丙氨酸解氨酶GbPAL3的核苷序列，其核苷序列为SEQIDNO.3；
一种编码苯丙氨酸解氨酶GbPAL4的核苷序列，其核苷序列为SEQIDNO.4；
一种编码苯丙氨酸解氨酶GbPAL5的核苷序列，其核苷序列为SEQIDNO.5；
一种编码肉桂酸4-羟化酶GbC4H1的核苷序列，其核苷序列为SEQIDNO.6；
一种编码肉桂酸4-羟化酶GbC4H2的核苷序列，其核苷序列为SEQIDNO.7；
一种编码香豆酰CoA连接酶Gb4CL1的核苷序列，其核苷序列为SEQIDNO.8；
一种编码香豆酰CoA连接酶Gb4CL2的核苷序列，其核苷序列为SEQIDNO.9；
一种编码香豆酰CoA连接酶Gb4CL3的核苷序列，其核苷序列为SEQIDNO.10；
一种编码查耳酮合成酶GbCHS的核苷序列，其核苷序列为SEQIDNO.11。


2.根据权利要求1所述的候选基因的功能验证，其特征在于，利用银杏幼苗，提取RNA并反转录作为模板，每个基因分别带有SacI和EcoRI酶切位点的两...

【专利技术属性】
技术研发人员：于荣敏，陈珊，訾佳辰，朱建华，
申请(专利权)人：于荣敏，
类型：发明
国别省市：广东;44