一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用，属于生物技术领域。所述提取方法包括如下步骤：(1)菲律宾蛤仔于4℃环境中培育后取肉；(2)提取菲律宾蛤仔抗冻蛋白粗提液的提取(3)制备冰壳(4)菲律宾蛤仔抗冻蛋白的纯化(5)收集抗冻蛋白。本发明专利技术所述方法提取方法易于操作，纯化过程简单且用时短，所得产品纯度高，更有利于实际生产，增加了产能，降低了成本。

【技术实现步骤摘要】
一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用
本专利技术涉及一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用，属于生物

技术介绍
菲律宾蛤仔对低温胁迫是一种积极主动地应激过程。抗冻蛋白(AntifreezeProtein，AFP)是一类能够抑制冰晶生长和重结晶的蛋白质，它能以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微，这种引起的熔点与冰点的差值称为热滞活性，因而抗冻蛋白亦称为热滞蛋白。抗冻蛋白在植物、海洋鱼类、昆虫和微生物中均有分布，目前没有发现从菲律宾蛤仔提取抗冻蛋白的报道。菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)属软体动物门，双壳纲、帘蛤目、帘蛤科。是广泛生活于中国南北沿海的埋栖贝类，具有重要的经济价值。目前在世界约200万吨的菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)产量中，约90％来自于养殖，且主要来自我国大陆的养殖(Goulletquer,1997)。在中国北方，蛤仔养殖过程中要经历冬季的低温，甚至冰冻，生存环境极差，但仍有菲律宾蛤仔正常越冬，体现了较强的抗寒性，是能够适应中国北方海域低温的优良经济贝类。目前，抗冻蛋白分离纯化主要有传统层析分离方法、SDS-PAGE电泳和浊点萃取法。传统方法分离周期长、过程繁琐、得率低、分离工艺不稳定、耗资昂贵和重复性差等缺点。
技术实现思路
本专利技术采用冰特异性吸附分离的方法提取了菲律宾蛤仔抗冻蛋白，冰特异性吸附分离法利用了冰对抗冻蛋白的特异吸附性，经一步分离步骤即可使抗冻蛋白的纯化倍数显著提高，比传统的色谱方法更加快捷高效，也能够避免造成抗冻活性的损失。一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白的提取方法，包括如下步骤：(1)将菲律宾蛤仔于0～4℃环境中培育至少一个月，取菲律宾蛤仔肉，用水清洗后保存备用；(2)菲律宾蛤仔抗冻蛋白粗提液的提取：菲律宾蛤仔肉与的缓冲液按1:2.8～3.2(m/v)的比例混合、匀浆，所得匀浆液离心后保留上清液，向上清液中加入水至体积与离心前匀浆液的体积相同，保存备用；(3)制备冰壳：在圆底烧瓶中加入去离子水，在液氮-无水乙醇浴或无机盐-水-冰混合浴中匀速旋转圆底烧瓶60～80s，使去离子水在圆底烧瓶内壁形成厚度均匀的冰壳，其中，形成冰壳的去离子水体积为初始去离子水体积的1/3～1/5；将剩余的去离子水倒出，再次将圆底烧瓶放入液氮-无水乙醇浴中匀速旋转20～40s，使圆底烧瓶内的冰壳完全冻结并形成裂缝；(4)菲律宾蛤仔抗冻蛋白的纯化：第一次纯化：将步骤(2)所得粗提液加入到步骤(3)制备的冰壳中，在-1～-1.5℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；第二次纯化：将第一次纯化后的冰壳于室温下融化后，加入体积比为1:4～5的缓冲液和去离子水，然后倒入另一冰壳中，在-0.5～-2℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；；第三次纯化：重复一次第二次纯化的步骤；(5)收集抗冻蛋白：将步骤(4)第三次纯化后所得产物于室温下融化后，用透析袋浓缩至体积为透析前的1/10，浓缩液离心，上清液冷冻干燥后得到白色粉末即为抗冻蛋白。进一步地，上述技术方案中，步骤(1)所述的菲律宾蛤仔选用规格一致且健康完整的；保存温度为-80～4℃。进一步地，上述技术方案中，所述缓冲液温度均为0～4℃；所述缓冲液均由50mMpH8.0Tris-HCl、100mMNaCl、1mM苯基硫脲、1mM乙二胺四乙酸和0.1mM苯甲基磺酰氯组成。进一步地，上述技术方案中，步骤(2)所述匀浆的时间为30～60s；步骤(2)所述离心的条件为0～4℃20000g离心30～40min；步骤(2)所述保存温度为0～4℃。进一步地，上述技术方案中，步骤(3)所述去离子水的温度为0～4℃；步骤(3)所述的液氮-无水乙醇浴为：在装有液氮的无盖容器中放入装有无水乙醇的无盖容器，圆底烧瓶在装有无水乙醇的无盖容器中匀速旋转形成冰壳；步骤(3)所述无机盐-水-冰混合浴中的冷却剂为：无机盐：水：冰比例为10:2:5(m/v/m)，所述无机盐包括氯化钙。进一步地，上述技术方案中，步骤(4)第一次纯化中将步骤(2)所得粗提液加入到步骤(3)制备的冰壳中的方法包括：将长颈漏斗插入圆底烧瓶中心后倒入粗提液或使用注射器注入粗提液，向冰壳中倒入或注入粗提液的时间为1-2min。进一步地，上述技术方案中，步骤(4)中的低温浴中添加有浴液，所述浴液包括无水乙醇；步骤(4)所述去离子水的温度为0～4℃。进一步地，上述技术方案中，步骤(5)透析的温度为0～4℃；步骤(5)所述透析袋的截留分子量是14000MwCO；步骤(5)所述离心的条件为0～4℃12000～15000g离心0.8～1h。本专利技术还提供了上述提取方法提取得到的菲律宾蛤仔抗冻蛋白。本专利技术还提供了菲律宾蛤仔抗冻蛋白在制备食品添加剂和抗冻剂中的应用。专利技术有益效果本专利技术提供了一种提取菲律宾蛤仔抗冻蛋白的方法，本专利技术采用旋转圆底烧瓶制备冰壳，使冰壳由外向内(外指的是靠近圆底烧瓶瓶壁的一侧，内指的是靠近圆底烧瓶中心的一侧)大面积生长，实现了菲律宾蛤仔抗冻蛋白的快速纯化。现有技术抗冻蛋白纯化一次需要至少1天，本专利技术只需要1～2h即可完成一次纯化，步骤简单，实验材料设备简单易得，更有利于实际生产，增加了产能，降低了成本。本专利技术经一步纯化步骤即可使抗冻蛋白的浓度显著提高，比传统方法更加快捷高效，也能够避免造成抗冻活性的损失。本专利技术以简单易得、价廉物美得蛤仔肉作为制备抗冻蛋白的原料，经过大量的实验，开发出简单高效从蛤仔肉中提取抗冻蛋白的制备方法，较易实现产业化生产，具有巨大的应用前景和市场价值。本专利技术所述方法提取出的菲律宾蛤仔抗冻蛋白的纯度为81.92％。附图说明图1为本专利技术实施例1制备的冰壳。图2为第二次纯化后过程中圆底烧瓶中未形成冰壳倒出的液体。图3为本专利技术实施例1第三次纯化后冰壳融化后的产物。图4为本专利技术实施例1制备的菲律宾蛤仔抗冻蛋白的考马斯蓝染色的SDS-PAGE图；其中，泳道1为marker、泳道2为菲律宾抗冻蛋白粗提液、泳道3为液体1、泳道4为冰1、泳道5为液体2、泳道6为冰2、泳道7为液体3、泳道8为冰3。具体实施方式下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。实施例1传统的冰特异性吸附是使用一个金属棒作为附着基，冰晶包裹金属棒由内向外形成，附着面积较小，本专利技术采用冰壳作为附着基，附着面积大。本方法优化了冰特异性吸附附着基，传统的冰亲和纯化法吸附纯化抗冻蛋白需要一天的时间，而现在仅需1～2小时即可完成一次纯化。传统的方法冰壳由本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)将菲律宾蛤仔于0～4℃环境中培育至少一个月，取菲律宾蛤仔肉，用水清洗后保存备用；/n(2)菲律宾蛤仔抗冻蛋白粗提液的提取：菲律宾蛤仔肉与的缓冲液按1:2.8～3.2(m/v)的比例混合、匀浆，所得匀浆液离心后保留上清液，向上清液中加入水至体积与离心前匀浆液的体积相同，保存备用；/n(3)制备冰壳：在圆底烧瓶中加入去离子水，在液氮-无水乙醇浴或无机盐-水-冰混合浴中匀速旋转圆底烧瓶60～80s，使去离子水在圆底烧瓶内壁形成厚度均匀的冰壳，其中，形成冰壳的去离子水体积为初始去离子水体积的1/3～1/5；将剩余的去离子水倒出，再次将圆底烧瓶放入液氮-无水乙醇浴中匀速旋转20～40s，使圆底烧瓶内的冰壳完全冻结并形成裂缝；/n(4)菲律宾蛤仔抗冻蛋白的纯化：/n第一次纯化：将步骤(2)所得粗提液加入到步骤(3)制备的冰壳中，在-1～-1.5℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；/n第二次纯化：将第一次纯化后的冰壳于室温下融化后，加入体积比为1:4～5的缓冲液和去离子水，然后倒入另一冰壳中，在-0.5～-2℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；/n第三次纯化：重复一次第二次纯化的步骤；/n(5)收集抗冻蛋白：将步骤(4)第三次纯化后所得产物于室温下融化后，用透析袋浓缩至体积为透析前的1/10，浓缩液离心，上清液冷冻干燥，即得抗冻蛋白。/n...

【技术特征摘要】
1.一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将菲律宾蛤仔于0～4℃环境中培育至少一个月，取菲律宾蛤仔肉，用水清洗后保存备用；
(2)菲律宾蛤仔抗冻蛋白粗提液的提取：菲律宾蛤仔肉与的缓冲液按1:2.8～3.2(m/v)的比例混合、匀浆，所得匀浆液离心后保留上清液，向上清液中加入水至体积与离心前匀浆液的体积相同，保存备用；
(3)制备冰壳：在圆底烧瓶中加入去离子水，在液氮-无水乙醇浴或无机盐-水-冰混合浴中匀速旋转圆底烧瓶60～80s，使去离子水在圆底烧瓶内壁形成厚度均匀的冰壳，其中，形成冰壳的去离子水体积为初始去离子水体积的1/3～1/5；将剩余的去离子水倒出，再次将圆底烧瓶放入液氮-无水乙醇浴中匀速旋转20～40s，使圆底烧瓶内的冰壳完全冻结并形成裂缝；
(4)菲律宾蛤仔抗冻蛋白的纯化：
第一次纯化：将步骤(2)所得粗提液加入到步骤(3)制备的冰壳中，在-1～-1.5℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；
第二次纯化：将第一次纯化后的冰壳于室温下融化后，加入体积比为1:4～5的缓冲液和去离子水，然后倒入另一冰壳中，在-0.5～-2℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；
第三次纯化：重复一次第二次纯化的步骤；
(5)收集抗冻蛋白：将步骤(4)第三次纯化后所得产物于室温下融化后，用透析袋浓缩至体积为透析前的1/10，浓缩液离心，上清液冷冻干燥，即得抗冻蛋白。


2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述的菲律宾蛤仔选用规格一致且健康完整的；保存温度为-80～4℃。

【专利技术属性】
技术研发人员：聂鸿涛，李宁，闫喜武，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21