微生物发酵液中代谢产物的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种微生物发酵液中代谢产物的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：(1)取待测微生物发酵液，置于‑70℃～‑90℃条件下4h～8h后，隔夜真空冷冻干燥，再用N,N‑二甲基甲酰胺溶解，涡旋震荡、离心所得上清液即为代谢产物溶液；(2)取所述代谢产物溶液，加入内标液混匀，再加衍生剂进行硅烷化衍生处理；(3)取所述衍生处理过的代谢产物溶液，进行GC‑MS检测。本发明专利技术通过对待测微生物发酵液的上述处理，能够尽可能保留所含代谢物并使这些代谢物尽可能多种类的提取出来，提取效率高。

【技术实现步骤摘要】
微生物发酵液中代谢产物的检测方法
本专利技术属于分析化学
，涉及一种微生物发酵液中代谢产物的检测方法。
技术介绍
发酵技术指的是人们利用微生物的发酵作用，运用一些技术手段控制发酵的过程，从而进行大规模生产发酵产品的技术。利用微生物的代谢活动，原材料在这种发酵环境下，生产人们所期望的食物，在食物中产生新的能够促进人体健康的化合物，同时去除具有不利健康潜力的物质，因此微生物被认为是决定发酵食品品质好坏的关键因素。发酵将有机物质转化成食品，使食品能抑制腐败菌和一般病原菌的生长，提高原有的未发酵食品的营养价值，使其原来的色泽，形状，风味按着人们的意愿去改变、日益被人们接受并喜欢。发酵食品之所以具有独特的风味且营养丰富，与其中发酵菌种发酵原材料产生种类丰富繁杂的代谢产物有极大关系。某些发酵食品中独特的风味及营养成分主要是原材料在微生物及酶的作用下转化形成代谢产物而产生的。这些代谢产物互相作用影响，产生独特的发酵产品风味。微生物的代谢产物有很多，已知的有37个大类，其中16类属于药物。在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂肪酸、维生素等，是菌体生长繁殖所必需的。这些产物叫做初级代谢产物，许多初级代谢产物分别形成了各种不同的发酵工业，如食品发酵行业，微生物发酵产生的代谢产物产生独特且有营养的发酵滋味。将一些不利于直接被人体消化吸收的原材料经过微生物分解吸收后形成更具有营养价值的物质，且代谢产物相互作用，还可以形成丰富的发酵物质和风味。发酵过程中微生物的代谢产物对发酵食品中的生物活性物质、食品特征以及风味等起着关键作用，因此对发酵食品中微生物代谢产物的研究能够更好地揭示微生物在发酵过程中的主要作用，通过对发酵代谢产物的定性定量分析，分析微生物与代谢物之间的关系可以更好地掌握微生物发酵机制，对产品的质量控制和工业化提供理论依据。目前，对代谢产物的研究主要通过提取待检测物，通过衍生化后利用GC-MS，HPLC等技术的支持，通过大型仪器检测出来，或者根据各类物质的理化性质按照国标方法进行测定。一般发酵产生的代谢产物主要有氨基酸类、有机酸类、脂肪酸类、糖类、醇类、酯类、酚类、酮类、胺类等有机物，每类物质都有自己独特的检测方法，这导致每种检测方法均具有局限性，包括提取待检测物、衍生化，很少能通过一种提取方法和衍生化试剂尽可能多的检测出代谢产物的种类，且一般检测时间长，检测效率低。另外根据国标的方法也只能大致检测某类代谢物的含量，至于具体是什么代谢物则测定不出来。因此，亟待提供一种能够同时从微生物发酵液中提取出多种代谢产物并进行检测的方法。
技术实现思路
基于此，本专利技术的主要目的是提供一种微生物发酵液中代谢产物的检测方法。该检测方法采用合适提取条件，能够使微生物发酵液中的代谢物尽可能提取出来，供后续检测。本专利技术的主要目的是通过以下技术方案实现的：一种微生物发酵液中代谢产物的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：(1)取待测微生物发酵液，置于-250℃～-50℃条件下4h～8h后，隔夜真空冷冻干燥，再用N,N-二甲基甲酰胺溶解，离心所得上清液即为代谢产物溶液；(2)取所述代谢产物溶液，加入内标液混匀，再加衍生剂进行硅烷化衍生处理；(3)取所述衍生处理过的代谢产物溶液，进行GC-MS检测。在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述的加衍生剂进行硅烷化衍生处理包括：加衍生剂，混匀、密封后于37℃～90℃条件下水浴1h～5h；所述衍生剂为双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷按体积比为(95～99.5)：(0.5～5)的混合溶液。在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述衍生剂为双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷按体积比为99:1的混合溶液。在其中一些实施例中，所述水浴的温度为78℃～82℃，所述水浴的时间为1.5h～2.5h，所述衍生剂为双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷按体积比为(98.5～99.5)：(0.5～1.5)的混合溶液。在其中一些实施例中，所述GC-MS检测采用的色谱条件包括：色谱柱：以5％二苯基1％乙烯基94％二甲基聚硅氧烷为填料的弱极性毛细管柱；载气：氦气；分流比：4.5～5.5；升温程序为：70℃保持8min；在8min～48min，以每分钟升温2.5℃～3.5℃的速度升温至190℃；48min～59min，以每分钟升温9.5℃～10.5℃的速度升温至300℃；以300℃保持31min。在其中一些实施例中，所述GC-MS检测采用的色谱条件包括：色谱柱：HP-5(0.25μm×30m×0.25mm)；载气：氦气；分流比：5.0；升温程序为：70℃保持8min；在8min～48min，以每分钟升温3℃的速度升温至190℃；48min～59min，以每分钟升温10℃的速度升温至300℃；以300℃保持31min。在其中一些实施例中，所述GC-MS检测采用的质谱条件包括：离子源温度：215℃～225℃，接口温度：245℃～255℃，溶剂延迟时间：3.5～4.5min，阈值：100～1000，开始时间：2.5min～3.5min，结束时间：56.5min～57.5min，间隔：0.3sec～0.5sec，扫描速度：500～1000，范围：40m/Z-500m/Z。在其中一些实施例中，所述GC-MS检测采用的质谱条件包括：离子源温度：220℃，接口温度：250℃，溶剂延迟时间：4min，阈值：1000，开始时间：3min，结束时间：57min，间隔：0.5sec，扫描速度：1000，范围：40m/Z-500m/Z。在其中一些实施例中，所述的内标溶液为向每10mLN,N-二甲基甲酰胺加入80mg～100mg十七烷酸颗粒制备而成的溶液。在其中一些实施例中，所述的步骤(1)中的待测微生物发酵液、N,N-二甲基甲酰胺及所述步骤(2)中内标溶液、衍生剂的体积比为(8～12)：(18～22)：1：(18～22)。在其中一些实施例中，所述的待测微生物发酵液为头抽酱油、生抽酱油、味极鲜酱油或大红浙醋。本专利技术所述的微生物发酵液包括对微生物进行液体培养所得的产物、对微生物进行非液态培养所得产物用溶剂分散之后所得的溶液、悬浮液等等。与现有技术相比，本专利技术具备如下有益效果：本专利技术的检测方法中，先将待测微生物发酵液置于-250℃～-50℃条件下4h～8h，再隔夜真空冷冻干燥、用N,N-二甲基甲酰胺溶解，经离心获得代谢产物溶液。本专利技术通过对待测微生物发酵液的上述处理，能够尽可能保留所含代谢物并使这些代谢物尽可能多种类的提取出来，提取效率高。进一步地，本专利技术在从微生物发酵液中提取到种类丰富的代谢产物之后，配合合适的硅烷衍生化处理，衍生剂中硅烷基取代代谢物分子中的酸性氢，即羧基、羟基、氨基、亚氨基及巯基等基团中的活泼氢，所得的衍生产物极性低，挥发性和热稳定性均较好，并且，该处理的衍生程度大，还能够使得一些非挥发性风味物质转化成挥发性物质被检测出来。同时，本专利技术配合合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微生物发酵液中代谢产物的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括如下步骤：/n(1)取待测微生物发酵液，置于-250℃～-50℃条件下4h～8h后，隔夜真空冷冻干燥，再用N,N-二甲基甲酰胺溶解，涡旋震荡、离心所得上清液即为代谢产物溶液；/n(2)取所述代谢产物溶液，加入内标液混匀，再加衍生剂进行硅烷化衍生处理；/n(3)取所述衍生处理过的代谢产物溶液，进行GC-MS检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种微生物发酵液中代谢产物的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括如下步骤：
(1)取待测微生物发酵液，置于-250℃～-50℃条件下4h～8h后，隔夜真空冷冻干燥，再用N,N-二甲基甲酰胺溶解，涡旋震荡、离心所得上清液即为代谢产物溶液；
(2)取所述代谢产物溶液，加入内标液混匀，再加衍生剂进行硅烷化衍生处理；
(3)取所述衍生处理过的代谢产物溶液，进行GC-MS检测。


2.根据权利要求1所述的微生物发酵液中代谢产物的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的加衍生剂进行硅烷化衍生处理包括：加衍生剂，混匀、密封后于37℃～90℃条件下水浴1h～5h；所述衍生剂为双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷按体积比为(95～99.5)：(0.5～5)的混合溶液。


3.根据权利要求2所述的微生物发酵液中代谢产物的检测方法，其特征在于，所述水浴的温度为78℃～82℃，所述水浴的时间为1.5h～2.5h，所述衍生剂为双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷按体积比为(98.5～99.5)：(0.5～1.5)的混合溶液。


4.根据权利要求1至3任一项所述的微生物发酵液中代谢产物的检测方法，其特征在于，所述GC-MS检测采用的色谱条件包括：
色谱柱：以5％二苯基1％乙烯基94％二甲基聚硅氧烷为填料的弱极性毛细管柱；载气：氦气；分流比：4.5～5.5；升温程序为：70℃保持8min；在8min～48min，以每分钟升温2.5℃～3.5℃的速度升温至190℃；48min～59min，以每分钟升温9.5℃～10.5℃的速度升温至300℃；以300℃保持31min。


5.根据权利要求4所述的微生物发酵液中代谢产物的检测方法，其特征在于，所述GC-MS检测采用的色谱条件包括：
色谱柱：HP-5(0.25μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亮明，赵国忠，孔德华，潘志辉，高琦豆，冯宜旭，姚云平，
申请(专利权)人：广州致美斋食品有限公司，广州市致美斋酱园有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44