检测DYNC2H1基因rs716274位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种DYNC2H1基因rs716274位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明专利技术采用DYNC2H1基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增DYNC2H1基因片段，同时在DYNC2H1基因特异性的引物界定的扩增区域内设计DYNC2H1基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3‑FAM和SEQ4‑VIC。本发明专利技术提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断DYNC2H1基因rs716274位点多态性的方法不仅准确率高，而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点，非常适合于在临床中大规模开展。

【技术实现步骤摘要】
检测DYNC2H1基因rs716274位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及DYNC2H1基因rs716274位点多态性的分型检测方法与试剂盒。
技术介绍
肺癌是全世界由癌症导致死亡的主要原因，可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者发病的概率高于前者。然而，占肺癌总数20%的小细胞肺癌是一种非常具有侵袭性的神经内分泌恶性肿瘤，其特点是生长速度快，倍增时间短，早期具有广泛转移的发展倾向且预后不良。近年来，铂类抗肿瘤药物的临床研究进展迅速，其抗肿瘤谱广，抗肿瘤活性强，不良反应降低，已成为目前抗肿瘤药物研发的重要领域。大多数小细胞肺癌患者对标准的一线铂类药物化疗有反应，但给予相同治疗方案的患者预后生存时间表现出高度多样化。个体临床特征例如年龄、吸烟史、疾病阶段对小细胞肺癌患者的预后影响较小，而近年来已经积累的证据表明肿瘤和宿主基因组中单核苷酸多态性（SNP）等遗传变异与患者的存活率相关，例如DYNC2H1基因rs716274（A/G）位点就是影响小细胞肺癌预后的遗传因素之一。与AA型位点相比，AG型和GG型预后生存时间逐渐减少，死亡风险增加。因此，对于小细胞肺癌患者进行该位点的分型检测对于改善治疗方案，预后评估具有重要价值。目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成非特异荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。分子信标（MolecularBeacon）在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团（F），3′端标记淬灭基团（Q）。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近（约为7-10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比（图1）。因此，理想的分子信标比Taqman水解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变（包括单碱基的错配、缺失或插入突变）效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。针对碱基的修饰改造也就是人工模拟的非天然核苷酸对的研究发展至今已有近40年的历史，这其中异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）及其衍生物5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoMeC-isoG）中的人工核苷酸对堪称经典。有关isoC-isoG中的核苷酸对的研究工作最早是由美国著名合成生物学家BennerSA开展的，其团队实现了异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）的人工扩展核酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。如图2所示，isoC和isoG分别是天然核苷酸C和G的异构体，它们自身可以完美配对，但无法与天然核苷酸之间形成配对。除了以上人工对碱基结构的改造，还有一大类基于对碱基糖环的改造的非天然核酸，如锁核酸（LNA）。LNA泛指含有一个或多个LNA单体（锁核苷酸）的寡核苷酸序列，是一类近年来迅速发展起来的并且已经在分子诊断、基因治疗等领域得到广泛应用的人工模拟核酸。如图3所示，LNA单体的戊糖环的2’-O和4’-C之间形成了一个亚甲基桥。LNA不改变天然核酸的碱基配对，但相对于天然核酸有着更强的亲和力以及更强的错配识别能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于人工模拟核酸的分子信标提供一种新型的DYNC2H1基因rs716274多态性位点的分型检测方法与试剂盒。为实现上述目的，本专利技术首先提供了用于检测人DYNC2H1基因rs716274位点多态性的分子信标。本专利技术提供的用于检测人DYNC2H1基因rs716274位点多态性的分子信标由分子信标甲和分子信标乙组成；所述分子信标甲的序列为序列表中序列2，其中，序列2第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基；所述分子信标乙的序列为序列表中序列3，其中，序列3第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。所述分子信标甲和所述分子信标乙的第7-25位均为环状区序列，第1-6位及第26-31位均为茎干区序列。所述分子信标甲和所述分子信标乙的环状区均靶向DYNC2H1基因rs716274位点。其中，所述分子信标甲靶向DYNC2H1基因rs716274位点的“A”；所述分子信标乙靶向DYNC2H1基因rs716274位点的“G”。进一步的，所述分子信标甲和所述分子信标乙的两端还标记有荧光基团和淬灭基团，且所述分子信标甲和所述分子信标乙标记的荧光基团不同。所述分子信标甲和所述分子信标乙标记的淬灭基团可以相同也可以不同。每个分子信标中，所述荧光基团发出的荧光可被所述淬灭基团吸收。所述荧光基团和所述淬灭基团可分别位于基础分子信标的5’末端和3’末端，所述荧光基团和所述淬灭基团的位置也可以交换，只要满足自由状态下的基础分子信标中的荧光基团发出的荧光可被淬灭基团淬灭即可。更进一步的，所述荧光基团可为FAM、Hex、TET、Cy3、JOE；所述淬灭基团可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测人DYNC2H1基因rs716274位点多态性的分子信标，其由分子信标甲和分子信标乙组成；/n所述分子信标甲的序列为序列表中序列2，其中，序列2第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基；/n所述分子信标乙的序列为序列表中序列3，其中，序列3第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测人DYNC2H1基因rs716274位点多态性的分子信标，其由分子信标甲和分子信标乙组成；
所述分子信标甲的序列为序列表中序列2，其中，序列2第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基；
所述分子信标乙的序列为序列表中序列3，其中，序列3第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。


2.根据权利要求1所述的分子信标，其特征在于：所述分子信标甲和所述分子信标乙的两端均标记有荧光基团和淬灭基团，且所述分子信标甲和所述分子信标乙标记的荧光基团不同。


3.权利要求2所述的分子信标，其特征在于：所述分子信标甲标记有FAM荧光基团；所述分子信标乙标记有VIC荧光基团。


4.用于检测人DYNC2H1基因rs716274位点多态性的成...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛猛，潘世让，余倩，杜柏均，王宏伟，
申请(专利权)人：北京福安华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11