数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒技术

本发明专利技术涉及核酸检测领域，特别涉及数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒。本发明专利技术提供的检测方法利用目标miRNA的整个序列信息，结合液滴微流控技术，构建了数字miRNA检测平台，具有较高的特异性和识别单碱基错配的能力。该平台能够在单分子水平上定量2‑20fM浓度范围内的miRNA，证明了该方法的有效性和实用性。首次实现了高选择性直接数字miRNA检测。

【技术实现步骤摘要】
数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒
本专利技术涉及核酸检测领域，特别涉及数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)检测在疾病诊断和miRNA功能研究中具有重要意义。miRNA本身的重要性在于它在各种生命过程中发挥的复杂调节功能及其与某些疾病的密切关系。miRNA是短的单链非编码RNA，长度范围为18-25nt，存在于真核细胞中。它们是由发夹样前体产生的，这些前体与RNA诱导的沉默复合物(RISC)中相应的靶mRNA碱基配对。由于碱基配对与其靶标完全或不完全互补，miRNA引起mRNA的降解或者抑制其翻译。miRNA表达水平在不同组织和器官中有所不同，并且受到精确调节；因此，它们的表达的功能障碍是有害的。由于miRNA短且高度同源，因此检测它们具有挑战性。用于检测miRNA的传统方法包括RT-PCR，RNA印迹，微阵列等；但是，这些方法中的每一种都有其各自的局限性。由于miRNA在体内的低丰度，某些靶向RNA的选择性扩增是必需的，数字化检测十分必要。值得注意的是，miRNA通常是短的，高度同源的，它们之间仅有微小的差异，这些特性使得常用的PCR扩增技术不准确且效率低下，同时PCR法复制miRNA需要加尾引物，难以应用于数字检测且特异性不高，检测的成本也比较高；RNA印迹法很复杂，需要进行放射性标记，而且会引起严重污染，检测效率低，检测限不够理想，难以应用于实际样本的痕量miRNA检测；微阵列具有良好的检测限，但所需的设备和材料成本高，因此限制了该方法的使用；许多新型生物传感器也被开发出来用于miRNA的检测，原理包括表面增强拉曼散射、电化学、表面等离共振、比色法、电化学发光、石英晶体微天平等，然而这些基于核酸杂交的方法在检测限或检测成本方法均存在不足，由于这些限制，开发更有效和低成本的检测方法是有意义和重要的。miRNA是化学生物学研究领域的重要目标，传统的检测方法不能满足当前的需求，所以需要开发具有更高的灵敏度和特异性，更简单，成本更低的新方法。作为一类短链和低丰度RNA靶标，miRNA检测将始终具有靶标再循环和/或信号放大的要求；这些因素在miRNA检测方法的设计中起着决定性作用。已经针对这些目的设计了各种酶促扩增和基于切割的反应。分子信标(Molecularbeacon)是一种荧光标记的寡核苷酸链。一般有三部分组成：①环状区：由15～30个可以与靶分子特异结合的核苷酸组成；②茎干区：一般由5～8个可发生可逆性解离的碱基对组成；③荧光基团和淬灭基团：分子信标的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团。没有靶分子的时候，分子信标的荧光和淬灭基团靠得很近，荧光被淬灭。与靶分子结合后，由于酶切作用，分子信标的空间构型发生改变，导致荧光恢复。因为分子信标技术具有极高的特异性和灵敏度，所以在临床诊断、基因检测、环境监测、活细胞成像、基因芯片与生物传感等方面得到了广泛应用。最近几年，为了提高检测目标分子的灵敏度，循环扩增技术在分子信标中的应用成为了研究热点，并广泛地应用于了各类目标分子的检测中去。数字化检测方法能够实现单分子级别的检测，检测限达到了理论上的极限，自问世以来便受到研究人员的推崇。因此开发一种较简便的miRNA循环反应策略，结合液滴微流控技术实现数字化miRNA检测具有必要性和重要意义。综上，利用分子信标开发核酸数字化检测的新方法，具有广泛的应用前景和重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了数字化miRNA检测方法、检测试剂及检测试剂盒。本专利技术提供了一种基于分子信标、靶标分子酶循环法和液滴微流控的数字化miRNA检测方法，具有更高的灵敏度和特异性，更简单，成本更低。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了数字化miRNA检测的方法，荧光基团修饰的分子信标和靶标miRNA经过特异性杂交后，在引物和克列诺片段的作用下，利用游离的核苷酸，发生补齐双链的链置换反应，逐渐取代靶标miRNA与分子信标进行结合，最终以分子信标为模板链补齐双链分子，分子信标的荧光恢复，靶标miRNA被挤脱下来重新变成游离状态，检测每个微液滴的荧光强度；所述分子信标探针的两端具有能够互补配对的序列，能够通过杂交配对形成茎环结构；所述靶标miRNA与分子信标的环状区域和部分茎干区的序列能够完全互补配对；同时与所述分子信标杂交后，所述引物和所述靶标miRNA之间留有至少2个碱基间隔。具体的，基于分子信标、靶标miRNA、DNA聚合酶的循环反应策略，结合液滴微流控技术进行直接数字化miRNA的检测，以荧光强度为测量参数对miRNA进行定量；其中，分子信标和靶标miRNA经过特异性杂交后，在引物和克列诺片段的作用下，利用游离的核苷酸，发生补齐双链的链置换反应，逐渐取代靶标miRNA与分子信标进行结合，最终以分子信标为模板链补齐双链分子，分子信标的荧光恢复，靶标miRNA被挤脱下来重新变成游离状态，在反应中回收利用。在本专利技术的一些具体实施方案中，基于液滴微流控技术，所述液滴微流控技术包括油相、第一水相和第二水相；所述第一水相通入靶标miRNA；所述第二水相通入引物、克列诺片段、游离的核苷酸和分子信标。具体的，所述液滴微流控技术，在第一水相中通入少量靶标miRNA，第二水相中通入足量的分子信标、引物和克列诺片段等循环反应物，通过流动聚焦生成的微液滴中含有足量的循环反应物和少量或者没有靶标miRNA，对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，实现直接数字化检测。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述第二水相还通入缓冲液以及可接受的助剂。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述分子信标的序列如SEQIDNo.1所示；所述靶标miRNA的序列如SEQIDNo.2所示；所述引物的序列如SEQIDNo.3所示。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了数字化miRNA检测的试剂，包括荧光基团修饰的分子信标、引物、克列诺片段、游离的核苷酸；所述分子信标探针的两端具有能够互补配对的序列，能够通过杂交配对形成茎环结构；所述靶标miRNA与分子信标的环状区域和部分茎干区的序列能够完全互补配对；同时与分子信标杂交后，所述引物和所述靶标miRNA之间留有至少2个碱基间隔。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述数字化miRNA检测的试剂还包括缓冲液、荧光染料以及检测可接受的助剂中的一种或多种。本专利技术还提供了数字化miRNA检测的试剂盒，包括所述的试剂以及检测可接受的装置。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述检测可接受的装置包括微流控芯片。本专利技术还提供了所述的试剂或所述的试剂盒在数字化miRNA检测中的应用。本专利技术提供的检测方法利用目标miRNA的整个序列信息，结合液滴微流控技术，构建了数字miRNA检测平台，具有较高的特异性和识别单碱基错配的能力。该平台能够在单分子水平上定量2-20fM浓度范围内的miRNA，证明了该方法的有效性和实用性。首次本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.数字化miRNA检测的方法，其特征在于，荧光基团修饰的分子信标和靶标miRNA经过特异性杂交后，在引物和克列诺片段的作用下，利用游离的核苷酸，发生补齐双链的链置换反应，逐渐取代靶标miRNA与分子信标进行结合，最终以分子信标为模板链补齐双链分子，分子信标的荧光恢复，靶标miRNA被挤脱下来重新变成游离状态，检测荧光强度；/n所述分子信标探针的两端具有能够互补配对的序列，能够通过杂交配对形成茎环结构；/n所述靶标miRNA与分子信标的环状区域和部分茎干区的序列能够完全互补配对；/n同时与所述分子信标杂交后，所述引物和所述靶标miRNA之间留有至少2个碱基间隔。/n

【技术特征摘要】
1.数字化miRNA检测的方法，其特征在于，荧光基团修饰的分子信标和靶标miRNA经过特异性杂交后，在引物和克列诺片段的作用下，利用游离的核苷酸，发生补齐双链的链置换反应，逐渐取代靶标miRNA与分子信标进行结合，最终以分子信标为模板链补齐双链分子，分子信标的荧光恢复，靶标miRNA被挤脱下来重新变成游离状态，检测荧光强度；
所述分子信标探针的两端具有能够互补配对的序列，能够通过杂交配对形成茎环结构；
所述靶标miRNA与分子信标的环状区域和部分茎干区的序列能够完全互补配对；
同时与所述分子信标杂交后，所述引物和所述靶标miRNA之间留有至少2个碱基间隔。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基于液滴微流控技术生成的微液滴中进行，并对各个所述微液滴的反应单元的荧光信号进行统计学分析，实现直接数字化检测。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，基于液滴微流控技术，所述液滴微流控技术包括油相、第一水相和第二水相；所述第一水相通入靶标miRNA；所述第二水相通入引物、克列诺片段、游离的核苷酸、分子信标以及可接受的循环反应物。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：任大海，王斌，尤政，李静，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11