凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记及其筛选制造技术

本发明专利技术公开了凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记及其筛选，通过将凡纳滨对虾进行亚硝酸盐氮胁迫实验，留取存活和死亡的凡纳滨对虾的肝胰腺作为样本，再用样本作为模板进行PCR扩增，并将扩增片段测序，得到肝胰腺DNA基因的部分序列以及测序峰图，将序列结果进行BLACT比对，筛选出碱基突变位点即SNP位点，再利用Seqman软件对测序的峰图进行基因分型分析，用SPSS19.0软件的卡方检验对凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮与基因型间的相关性进行分析，得到与凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮显著相关的SNP标记，该标记用于凡纳滨对虾的选择育种，可以准确、高效地选择出具有耐亚硝酸盐氮性状的凡纳滨对虾进行规模养殖。

【技术实现步骤摘要】
凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记及其筛选
本专利技术属于分子标记
，具体涉及凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记及其筛选。
技术介绍
凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)俗称南美白对虾，属于甲壳纲、十足目、对虾科、对虾属、滨对虾亚属，原产于美洲太平洋沿岸海域，秘鲁南部至墨西哥桑诺拉沿海海域分布较多，以厄瓜多尔最集中。凡纳滨对虾具有个体大、生长快、适应能力强、饲料蛋白需求低、抗病能力强、离水存活时间长和适合长途运输销售等优点；其肉质肥嫩味美，营养丰富，出肉率高达65％，是世界三大优良对虾养殖品种之一。自1988年开始，我国开展了凡纳滨对虾的引进、适应性养殖以及大面积推广工作，进入2000年以后，我国凡纳滨对虾养殖规模逐年扩大，至2013年，仅广东省凡纳滨对虾养殖面积就达到了6.8万公顷，产量达到32.84万吨。随着养殖水平的不断提高，养殖密度的不断加大，投入的饲料量大,养殖代谢产物积累，水交换量少，环境负荷大，导致水质因子波动频繁，养殖环境稳定性变差，从而影响养殖凡纳滨对虾的健康成长，而且凡纳滨对虾等高档水产品所投喂的饲料蛋白质含量较高，所产生的粪便蛋白质含量较高，水体的负载大都达到或超过饱和程度，在常规微生物的作用下，有机碳源被大量分解，而有机氮源残剩过多，特别在氧气不足的条件，过多的氮源很容易转化为亚硝酸盐和氨氮，给凡纳滨对虾生长造成了有毒环境。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术公开凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记及其筛选，可以快速筛选出凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的SNP标记，用于选育具有耐亚硝酸盐氮性状的凡纳滨对虾品种。本专利技术是采用如下技术方案实现的：凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记，所述分子标记包括SNP分子标记A、SNP分子标记B和SNP分子标记C中任一个；所述SNP分子标记A是如SEQIDNO.1所示核苷酸序列，其中自5’端起第169位碱基中的Y为C或T，SEQIDNO.1所示核苷酸序列如下：TGGAATACATGCTATTTCTYTTTTCGTTCATAGACAAAGGT，150bp～190bp；所述SNP分子标记B是如SEQIDNO.2所示核苷酸序列，其中自5’端起第192位碱基中的Y为C或T，SEQIDNO.2所示核苷酸序列如下：ACTGGCGGACTTTTTTGTGATCYGAGTTATAGTTCAGATTGGCATTTTCAT，大小为170bp～220bp；所述SNP分子标记C是如SEQIDNO.3所示核苷酸序列，其中自5’端起第275位碱基中的Y为C或T，SEQIDNO.3所示核苷酸序列如下：GCATTATGGATATCTTCTTGCTTTAYGATTGAAAAAAGTCCGGCCTAACCC，大小为250bp～300bp。进一步的，凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的检测引物，其包括用于SNP分子标记A检测的引物对A和用于SNP分子标记B检测的引物对B；所述引物对A为引物SCLF25-2和引物SCLR25-2；所述引物对B为引物SCLF25-5和引物SCLR25-5；所述引物SCLF25-2为SEQIDNO.4所示序列，引物SCLR25-2为SEQIDNO.5所示序列，所述引物SCLF25-5为SEQIDNO.6所示序列，引物SCLR25-5为SEQIDNO.7所示序列，SEQIDNO.4所示序列为CCTTCAGGACAGCGTCAATG；SEQIDNO.5所示序列为GAGCATGTCTGACAGGAACCTTC；SEQIDNO.6所示序列为TTCTTGAGGCGGCAGGTCT；SEQIDNO.7所示序列为TCGCCTTTTTTGGAATACTCT。上述凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的筛选方法，其包括如下步骤：(1)用体积为1000L的塑料圆桶，装入养殖水体为500L，添加药品级的亚硝酸钠并且调节亚硝酸盐氮的浓度为757.18mg/L，然后放入至少30尾凡纳滨对虾进行亚硝酸盐氮胁迫实验，实验过程中不投喂饲料且亚硝酸盐氮的浓度控制在600～757.18mg/L；(2)亚硝酸盐氮胁迫实验的时间为96小时，实验过程中每隔24小时换新水一次，并重新调节亚硝酸盐氮的浓度为757.18mg/L，当凡纳滨对虾侧翻后用木棍触碰无迅速游走或无明显反应，并且仍然呈侧翻姿势则视为死亡；亚硝酸盐氮胁迫实验结束后，留取存活和死亡的凡纳滨对虾的肝胰腺作为样本，用液氮保存；(3)用步骤(2)中得到的样本提取DNA，具体是称取样本100mg，加入600μLDNA提取缓冲液浸泡，并用剪刀剪碎样本后加入12μL20mg/mL蛋白酶K混匀，充分混匀后放人56℃水浴锅中温浴3h；取出冷却至室温，加人200μL/mL7.5mmol/L醋酸铵溶液，颠倒混匀2min，14000r/min离心5min，取上清至另一离心管，加入等体积预冷异丙醇，在-80℃下放置15min，随后14000r/min离心5min，取沉淀用70％乙醇洗涤2～3次，接着自然干燥后，加人100μL灭菌ddH2O，再加人1μL10mg/mL胰RNA酶37℃水浴30min，在-20℃下保存备用；将所得到的DNA作为模板，利用如权利要求2所述的引物对A或引物对B进行PCR扩增，获得扩增片段；将扩增片段进行测序，得到肝胰腺DNA基因的部分序列以及测序峰图，将序列结果进行BLACT比对，筛选出碱基突变位点即SNP位点；(4)利用Seqman软件对测序的峰图进行基因分型分析，若在SNP位点处出现双峰则说明是杂合型，单峰则是纯合子；用SPSS19.0软件的卡方检验对凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮与基因型间的相关性进行分析，得到与凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮显著相关的SNP标记。进一步的，步骤(3)中所述PCR扩增的扩增反应体系总体积为10ul，并且由以下体积的组分组成：模板1ul、上引物0.2ul、下引物0.2ul、扩增Mix5ul、余量为超纯水；扩增程序为：94℃预热3min，然后依次94℃30s，60℃30s，72℃40s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。进一步的，步骤(3)中所述DNA提取缓冲液为10mmol/LTris-HClpH＝8.0，100mmol/LEDTApH＝8.0，2％SDS。上述凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的应用，是在凡纳滨对虾的选择育种过程中，对凡纳滨对虾育种候选群体进行SNP位点分型，再结合耐亚硝酸盐氮性状相关位点的分型信息，选择具有耐亚硝酸盐氮性状的凡纳滨对虾进行规模养殖或者作为选育的亲本。本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：1.本专利技术采用合理的亚硝酸盐氮胁迫实验，留取存活和死亡的凡纳滨对虾的肝胰腺作为样本，然后提取样本的DNA作为模板，利用自主设计的特异性引物进行PCR扩增，对扩增片段进行测序、比对和分析，得到与凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮显著相关的SNP标记，进而，通过检测不同育种候选群体的上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记，其特征在于：所述分子标记包括SNP分子标记A、SNP分子标记B和SNP分子标记C中任一个；/n所述SNP分子标记A是如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，其中自5’端起第169位碱基中的Y为C或T，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列如下：/nTGGAATACATGCTATTTCTYTTTTCGTTCATAGACAAAGGT；/n所述SNP分子标记B是如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，其中自5’端起第192位碱基中的Y为C或T，SEQ ID NO.2所示核苷酸序列如下：/nACTGGCGGACTTTTTTGTGATCYGAGTTATAGTTCAGATTGGCATTTTCAT；/n所述SNP分子标记C是如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，其中自5’端起第275位碱基中的Y为C或T，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列如下：/nGCATTATGGATATCTTCTTGCTTTAYGATTGAAAAAAGTCCGGCCTAACCC。/n

【技术特征摘要】
1.凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记，其特征在于：所述分子标记包括SNP分子标记A、SNP分子标记B和SNP分子标记C中任一个；
所述SNP分子标记A是如SEQIDNO.1所示核苷酸序列，其中自5’端起第169位碱基中的Y为C或T，SEQIDNO.1所示核苷酸序列如下：
TGGAATACATGCTATTTCTYTTTTCGTTCATAGACAAAGGT；
所述SNP分子标记B是如SEQIDNO.2所示核苷酸序列，其中自5’端起第192位碱基中的Y为C或T，SEQIDNO.2所示核苷酸序列如下：
ACTGGCGGACTTTTTTGTGATCYGAGTTATAGTTCAGATTGGCATTTTCAT；
所述SNP分子标记C是如SEQIDNO.3所示核苷酸序列，其中自5’端起第275位碱基中的Y为C或T，SEQIDNO.3所示核苷酸序列如下：
GCATTATGGATATCTTCTTGCTTTAYGATTGAAAAAAGTCCGGCCTAACCC。


2.如权利要求1所述凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的检测引物，其特征在于：包括用于SNP分子标记A检测的引物对A和用于SNP分子标记B检测的引物对B；所述引物对A为引物SCLF25-2和引物SCLR25-2；所述引物对B为引物SCLF25-5和引物SCLR25-5；所述引物SCLF25-2为SEQIDNO.4所示序列，引物SCLR25-2为SEQIDNO.5所示序列，所述引物SCLF25-5为SEQIDNO.6所示序列，引物SCLR25-5为SEQIDNO.7所示序列。


3.如权利要求1所述凡纳滨对虾耐亚硝酸盐氮性状相关的分子标记的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)用体积为1000L的塑料圆桶，装入养殖水体为500L，添加药品级的亚硝酸钠并且调节亚硝酸盐氮的浓度为757.18mg/L，然后放入至少30尾凡纳滨对虾进行亚硝酸盐氮胁迫实验，实验过程中不投喂饲料且亚硝酸盐氮的浓度控制在600～757.18mg/L；
(2)亚硝酸盐氮胁迫实验的时间为96小时，实验过程中每隔24小时换新水一次，并重新调节亚硝酸盐氮的浓度为757.18mg/L，当凡纳滨对虾侧翻后用木棍触碰无迅速游走或无明显反应，并且仍然呈侧翻姿势则视为死亡；亚硝酸盐氮胁迫实验结束后，留取存活和死亡的凡纳滨对虾的肝胰腺作为样本，用液氮...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永贞，杨春玲，刘青云，李强勇，陈晓汉，彭敏，曾地刚，陈秀荔，朱威霖，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：广西;45