基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法，其先利用低速离心除去死亡细胞或细胞碎片，再以高速离心除去大的囊泡，最后用两次超高速离心获得高纯度外泌体，接着通过FASP方法进行外泌体蛋白酶解，并运用生物质谱进行检测和数据分析，为外泌体蛋白质组研究提供新的可靠方法，具有纯度高、结果可靠等优势。

【技术实现步骤摘要】
基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法
本专利技术涉及生物技术检测领域，具体涉及一种基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法。
技术介绍
外泌体(exosome)是一类由体内多种活细胞分泌的纳米级双层膜结构小囊泡，可以携带包含亲代细胞信息的核酸、蛋白和脂质等。通常，外泌体粒径为几十至一百五十纳米，大部分外泌体具有一些特殊功能，可能与细胞信号转到功能有关。现已发现外泌体参与癌症转移、肿瘤浸润、血管新生、免疫细胞调节等多种环节。目前的肿瘤细胞发生、生长、侵袭、转移等作用机制研究中的检测方法往往因为外泌体的浓度不足或者纯度不足而影响到检测的准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法，其先利用低速离心除去死亡细胞或细胞碎片，再以高速离心除去大的囊泡，最后用两次超高速离心获得高纯度外泌体，接着通过FASP方法进行外泌体蛋白酶解，并运用生物质谱进行检测和数据分析，为外泌体蛋白质组研究提供新的可靠方法，具有纯度高、结果可靠等优势。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法，包括如下步骤：步骤S1，取细胞上清样品，由低速到高速进行多次不同速度的离心，取上清液，备用；步骤S2，将步骤S1获得的上清液进行超高速离心，弃上清，更换外泌体环境试剂为磷酸缓冲盐溶液，再次进行超高速离心富集外泌体；步骤S3，向步骤S2中获得的外泌体样品先后加入SDS裂解液和SDT裂解液，对外泌体蛋白进行裂解变性，采用UA缓冲液冲洗掉裂解液，再加入碘乙酰胺对变性蛋白进行烷基化保护，采用UA缓冲液冲洗掉碘乙酰胺，并将环境溶液更换为NH4HCO3溶液，并加入胰蛋白酶于37℃，600rpm，酶解变性反应20小时，离心并收集洗脱液，冷冻干燥，进行蛋白质定量分析；步骤S4，将步骤S3获得的样品甲酸溶液进行高效液相色谱-串联质谱分析，再通过数据库检索，定性分析蛋白。根据以上方案，所述的步骤S1中的由低速到高速进行多次不同速度的离心包括先以800g，4℃离心15min，取上清，再以2,000g，4℃离心30min，取上清，再以7,500g，4℃离心30min，取上清。根据以上方案，所述的步骤S2中的超高速离心是100,000g，4℃离心2h；步骤S2详细包括，使用0.22μm滤膜过滤步骤S1获得的上清液，再进行超高速离心后去除大部分上清液，混匀剩余上清液和沉淀，转移至新离心管后加入磷酸缓冲盐溶液重悬，再次进行超高速离心后，去除上清，使用磷酸缓冲盐溶液重悬。根据以上方案，所述的步骤S3中的裂解变性是先采用含4％SDS和100mMTris-HCl的裂解液进行裂解，再采用BCA对样品定量，再取50μg样品加入30μL的SDT裂解液，95℃裂解5min；所述的步骤S3中的采用UA缓冲液冲洗是将样品转入10KDa超滤管，加入100-200μLUA缓冲液，以14,000g室温离心20min，重复3次加入UA缓冲液离心冲洗；所述的步骤S3中的烷基化保护具体是加入100μL100mM碘乙酰胺，600rpm混匀1min,再黑暗室温静置20min；所述的步骤S3中的将环境溶液更换为NH4HCO3溶液具体是加入100μL的25mM的NH4HCO3，14,000g室温离心15min，重复加入冲洗3次后，再加入50μL25mM的NH4HCO3，室温600rpm混匀1min；所述的步骤S3中的离心并收集洗脱液包括14,000g室温离心15min。加入40μL25mM的NH4HCO3，600rpm室温混匀1min，再以14,000g室温离心20min，收集洗脱液。根据以上方案，所述的蛋白质定量分析是用10μL0.1％甲酸溶液复溶样品，采用nanoDrop定量分析。根据以上方案，所述的步骤S4中的高效液相色谱的缓冲液的A液是0.1％甲酸水溶液，B液是0.1％甲酸乙腈水溶液，所述的甲酸乙腈水溶液的乙腈含量为84％；液相梯度如下：0min-43min，B液线性梯度从0％-35％；43mi-50min，B液线性梯度从35％-45％；50min-52min，B液线性梯度从45％-100％；52min-60min，B液维持在100％；流速为300nl/min。根据以上方案，所述的质谱分析条件是，采用正离子扫描模式，分析时长：60min，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：70,000atm/z200，最大增益控制(AGCtarget)：3e6，一级最大进样时间(MaximumIT)：25ms，扫描范围数目(Numberofscanranges)：1，动态排除时间(Dynamicexclusion)：30.0s；二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描(fullscan)后采集20个碎片图谱(MS2scan)，MS2解离模式(MS2ActivationType)：高能碰撞解离(HCD)，隔离窗口(Isolationwindow)：1.5m/z，二级质谱分辨率：15,000atm/z200，Microscans：1，二级最大进样时间(MaximumIT)：25ms，碰撞能量(Normalizedcollisionenergy)：27eV，最小填充比(Underfillratio)：0.1％。本专利技术的有益效果是：1)本专利技术首次通过差速超离富集细胞上清外泌体，并进行蛋白质组研究，为细胞上清外泌体蛋白质组研究提供新的实验方法。2)本专利技术此方法与现有方法相比，具有纯度高、结果可靠等优势，为细胞上清中外泌体蛋白质组研究开辟了一条新的途径。附图说明图1是本专利技术实施例中的外泌体电镜图。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术的技术方案进行说明。一种基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法，包括如下步骤：步骤S1，取细胞上清样品100ml，先以800g，4℃离心15min，取上清，再以2,000g，4℃离心30min，取上清，再以7,500g，4℃离心30min，取上清，备用。步骤S2，使用0.22μm滤膜过滤步骤S1获得的上清液，配平，再以100,000g，4℃离心2h，去除大部分上清液，混匀剩余上清液和沉淀后转移至新离心管，再加入磷酸缓冲盐溶液重悬，配平，再以100,000g，4℃离心2h，去掉上清液后再加入50μl磷酸缓冲盐溶液，得富集后的外泌体样品，备用；所得样品用BCA法定量，样品取5μg，用CD9，CD63，CD81进行蛋白印迹(westernblot)验证，外泌体透射电镜图例如图1。步骤S3，向步骤S2中获得的外泌体样品中先采用含4％SDS和100mMTris-HCl的裂解液进行裂解，再采用BCA法对样品定量，再取50μg样品加入30μL的SDT裂解液，95℃裂解5min，对外泌体蛋白进行裂解变性；将样品转入10KDa超滤管，加入200μLUA缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤S1，取细胞上清样品，由低速到高速进行多次不同速度的离心，取上清液，备用；/n步骤S2，将步骤S1获得的上清液进行超高速离心，弃上清，更换外泌体环境试剂为磷酸缓冲盐溶液，再次进行超高速离心富集外泌体；/n步骤S3，向步骤S2中获得的外泌体样品先后加入SDS裂解液和SDT裂解液，对外泌体蛋白进行裂解变性，采用UA缓冲液冲洗掉裂解液，再加入碘乙酰胺对变性蛋白进行烷基化保护，采用UA缓冲液冲洗掉碘乙酰胺，并将环境溶液更换为NH

【技术特征摘要】
1.基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，取细胞上清样品，由低速到高速进行多次不同速度的离心，取上清液，备用；
步骤S2，将步骤S1获得的上清液进行超高速离心，弃上清，更换外泌体环境试剂为磷酸缓冲盐溶液，再次进行超高速离心富集外泌体；
步骤S3，向步骤S2中获得的外泌体样品先后加入SDS裂解液和SDT裂解液，对外泌体蛋白进行裂解变性，采用UA缓冲液冲洗掉裂解液，再加入碘乙酰胺对变性蛋白进行烷基化保护，采用UA缓冲液冲洗掉碘乙酰胺，并将环境溶液更换为NH4HCO3溶液，并加入胰蛋白酶于37℃，600rpm，酶解变性反应20小时，离心并收集洗脱液，冷冻干燥，进行蛋白质定量分析；
步骤S4，将步骤S3获得的样品甲酸溶液进行高效液相色谱-串联质谱分析，再通过数据库检索，定性分析蛋白。


2.根据权利要求1所述的基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法，其特征在于，所述的步骤S1中的由低速到高速进行多次不同速度的离心包括先以800g，4℃离心15min，取上清，再以2,000g，4℃离心30min，取上清，再以7,500g，4℃离心30min，取上清。


3.根据权利要求1所述的基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法，其特征在于，所述的步骤S2中的超高速离心是100,000g，4℃离心2h；步骤S2详细包括，使用0.22μm滤膜过滤步骤S1获得的上清液，再进行超高速离心后去除大部分上清液，混匀剩余上清液和沉淀，转移至新离心管后加入磷酸缓冲盐溶液重悬，再次进行超高速离心后，去除上清，使用磷酸缓冲盐溶液重悬。


4.根据权利要求1所述的基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法，其特征在于，所述的步骤S3中的裂解变性是先采用含4％SDS和100mMTris-HCl的裂解液进行裂解，再采用BCA对样品定量，再取50μg样品加入30μL的SDT裂解液，95℃裂解5min；
所述的步骤S3中的采用UA缓冲液冲洗是将样品转入10KDa超滤管，加入100-200μLUA缓冲液，以14,000g室温离心20min，重复3次加入UA缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：张益，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31