抑制TIMP-1基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其用途制造技术

一种抑制TIMP‑1基因表达的siRNA，含有正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II的长度均为19个核苷酸，核苷酸序列II至少部分地与TIMP‑1mRNA第350‑700位区域中长度为19个连续核苷酸的序列互补。按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。本公开还提供了包含该siRNA的药物组合物。该siRNA和含有该siRNA的药物组合物能够治疗或改善与TIMP‑1基因表达相关的疾病。

【技术实现步骤摘要】
抑制TIMP-1基因表达的siRNA、含有该siRNA的药物组合物及其用途
本公开涉及一种能够抑制TIMP-1基因表达的核酸和含有该核酸的药物组合物，属于核酸制药领域。本公开还涉及这些核酸和药物组合物的用途。
技术介绍
肝纤维化是继发于各种形式慢性肝损伤之后的组织修复过程中的代偿反应，也是慢性肝病发展为肝硬化、肝癌等严重致死性疾病的必经病变过程，所以抗肝纤维化成为慢性肝病治疗的重中之重。目前防治肝纤维化的手段非常有限，主要包括两大方面：一是针对原发病去除致病因素，如抗病毒、戒酒等；二是针对肝纤维化本身的治疗，如通过抑制炎症或脂质过氧化，或者抑制肝星状细胞(HSC)的增殖活化，以及促进胶原降解等。临床药物中，使用干扰素抑制星状细胞的激活和增殖细胞外基质的表达，使用拉米夫定抑制HBVDNA的复制，使用秋水仙碱和水飞蓟素干扰细胞的胶原分泌。但这些药物对肝纤维化的治疗效果不确切，对肝纤维化患者生存率也无明显改善，而副作用发生率却明显增加。基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)是近年发现的一种由巨噬细胞和结缔组织细胞产生，抑制细胞外基质降解的蛋白。从分子水平来看，在纤维化发病过程中，TIMP-1的表达升高是关键事件之一。抑制这一基因的表达，能够增强细胞外基质的降解，减少组织胶原纤维的合成和堆积，从而有可能避免纤维化的发生。前期研究以腺病毒为载体实现肝靶向递送针对TIMP-1的siRNA，结果显示TIMP-1siRNA在CCL4和BDL纤维化模型中均显示出显著的抗纤维化效果(AmJPathol.2013,182(5):1607-16)，提示TIMP-1可以作为治疗纤维化的靶点基因，用于纤维化的治疗。然而迄今为止，用于治疗与TIMP-1基因表达相关的疾病的siRNA药物临床应用进展缓慢，其中，siRNA本身的活性和在血液中的稳定性较差，是影响该类药物进展缓慢的原因之一。因此，迫切需要开发一种具有潜在临床应用价值的，具有良好稳定性和生物活性的，用于治疗与TIMP-1基因表达相关的疾病的siRNA和含siRNA的药物组合物。
技术实现思路
在一些实施方式中，本公开提供了一种能够抑制TIMP-1基因表达的siRNA，该siRNA含有正义链和反义链，所述正义链和反义链的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，其中，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II的长度均为19个核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列选自TIMP-1mRNA第350-700位区域中长度为19个连续核苷酸的序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列II的5'末端的第一个核苷酸是反义链5'末端的第一个核苷酸，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本公开的siRNA和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，本公开提供了本公开的siRNA和/或药物组合物在制备用于治疗或改善与TIMP-1基因表达相关的疾病的药物中的应用。在一些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本公开的siRNA和/或药物组合物。以引用的方式并入本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利以及专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。有益效果本公开提供的siRNA和含该siRNA的药物组合物具有良好的稳定性，较高的基因抑制活性，很低的脱靶效应，和/或能显著改善肝纤维化水平。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA或含该siRNA的药物组合物具有更高的稳定性和/或更高的活性。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA或药物组合物显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或85％的靶基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA或含该siRNA的药物组合物未显示出明显脱靶效应。脱靶效应可以是例如抑制非靶基因的基因正常表达。据认为，如果脱靶基因表达的结合/抑制与在靶基因效果相比低于50％、40％、30％、20％或10％时，该脱靶效应就是不显著的。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA具有良好的稳定性，在体外溶酶体裂解液中、人血浆或猴血浆中都保持着一致的稳定性。由此说明，本公开提供的siRNA或药物组合物能够抑制TIMP-1基因的表达，有效治疗或改善与TIMP-1基因表达相关的疾病，具有良好的应用前景。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。在本公开中，TIMP-1基因以及靶基因都是指mRNA序列如Genbank注册号NM_003254.2所示的基因。定义在上文及下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。在上文及下文中，所述“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridgednucleicacid，简称BNA)或无环核苷酸。所述“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。在本文的上下文中，“互补”或“反向互补”一词可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够抑制TIMP-1基因表达的siRNA，所述siRNA含有正义链和反义链，所述正义链和反义链的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，其中，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II的长度均为19个核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列选自TIMP-1 mRNA第350-700位区域中长度为19个连续核苷酸的序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列II的5'末端的第一个核苷酸是反义链5'末端的第一个核苷酸，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种能够抑制TIMP-1基因表达的siRNA，所述siRNA含有正义链和反义链，所述正义链和反义链的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，其中，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II的长度均为19个核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列选自TIMP-1mRNA第350-700位区域中长度为19个连续核苷酸的序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列II的5'末端的第一个核苷酸是反义链5'末端的第一个核苷酸，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。


2.根据权利要求1所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸。
优选地，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。


3.根据权利要求1所述的siRNA，其中，核苷酸序列II与第一段核苷酸序列基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；
优选地，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的至少第2-19位的核苷酸与第一段核苷酸序列互补。


4.根据权利要求1-3中任意一项所述的siRNA，其中，
所述核苷酸序列I与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，所述核苷酸序列Ⅱ与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CGUUAUGAGAUCAAGAUGZa1-3'(SEQIDNO:1)；
5'-Zb1CAUCUUGAUCUCAUAACG-3'(SEQIDNO:2)，
其中，Za1为A，Zb1为U，
所述核苷酸序列I中包含位置对应于Za1的核苷酸ZA1，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zb1的核苷酸ZB1，所述ZB1是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；或者
所述核苷酸序列Ⅰ与SEQIDNO:3所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，所述核苷酸序列Ⅱ与SEQIDNO:4所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GCAGCGAGGAGUUUCUCAZa2-3'(SEQIDNO:3)；
5'-Zb2UGAGAAACUCCUCGCUGC-3'(SEQIDNO:4)，
其中，Za2为U，Zb2为A，
所述核苷酸序列I中包含位置对应于Za2的核苷酸ZA2，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zb2的核苷酸ZB2，所述ZB2是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；或者
所述核苷酸序列Ⅰ与SEQIDNO:5所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，所述核苷酸序列Ⅱ与SEQIDNO:6所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CACAGUGUUUCCCUGUUUZa3-3'(SEQIDNO:5)；
5'-Zb3AAACAGGGAAACACUGUG-3'(SEQIDNO:6)，
其中，Za3为A，Zb3为U，
所述核苷酸序列I中包含位置对应于Za3的核苷酸ZA3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zb3的核苷酸ZB3，所述ZB3是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；
优选地，所述核苷酸序列I与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；或者
所述核苷酸序列I与SEQIDNO:3所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQIDNO:4所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；或者
所述核苷酸序列I与SEQIDNO:5所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQIDNO:6所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；
优选地，所述核苷酸序列II与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括ZB1位置处的差异，且ZB1选自A、C或G，优选地，ZA1是与ZB1互补的核苷酸；或者
所述核苷酸序列II与SEQIDNO:4所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括ZB2位置处的差异，且ZB2选自U、C或G，优选地，ZA2是与ZB2互补的核苷酸；或者
所述核苷酸序列II与SEQIDNO:6所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括ZB3位置处的差异，且ZB3选自A、C或G，优选地，ZA3是与ZB3互补的核苷酸。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。


6.根据权利要求5所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I为SEQIDNO:7所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQIDNO:8所示的序列；或者
所述核苷酸序列I为SEQIDNO:9所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQIDNO:10所示的序列；或者
所述核苷酸序列I为SEQIDNO:11所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQIDNO:12所示的序列；






其中，
ZB1是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA1选自A、U、G或C，并且ZB1是与ZA1互补的核苷酸；
ZB2是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA2选自A、U、G或C，并且ZB2是与ZA2互补的核苷酸；
ZB3是反义链5'末端的第一个核苷酸，ZA3选自A、U、G或C，并且ZB3是与ZA3互补的核苷酸；
优选地，ZA1为U，ZB1为A；ZA2为U，ZB2为A；ZA3为U，ZB3为A。


7.根据权利要求1-6中任意一项所述的siRNA，其中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV的长度各自为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补，所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，并且所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中与第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。


8.根据权利要求7所述的siRNA，其中，所述siRNA为如下siRNA中的一种：
1)所述核苷酸序列I为SEQIDNO:7所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQIDNO:8所示的序列，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为G；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为A和G；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为C、A和G；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为C、C、A和G；
2)所述核苷酸序列I为SEQIDNO:9所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQIDNO:10所示的序列，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为C；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为C和C；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为A、C和C；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基依次为A、A、C和C；
3)所述核苷酸序列I为SEQIDNO:11所示的序列，所述核苷酸序列II为SEQIDNO:12所示的序列，所述核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鸿雁，高山，康代武，
申请(专利权)人：苏州瑞博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32