制备右旋酮洛芬的方法技术

本发明专利技术提出了一种制备右旋酮洛芬的方法。该方法包括使酰胺酮洛芬在酰胺酶的催化下进行脱氨基反应，以便获得右旋酮洛芬，所述酰胺酶来源于Agrobacterium。发明专利技术人发现，来源于Agrobacterium的酰胺酶对右旋酰胺酮洛芬的特异性识别能力更强，使用来源于Agrobacterium的酰胺酶制备右旋酮洛芬，可大大提高右旋酮洛芬的ee值。

【技术实现步骤摘要】
制备右旋酮洛芬的方法
本专利技术涉及生物工程领域，具体地，本专利技术涉及制备右旋酮洛芬的方法。
技术介绍
酮洛芬是2-芳基丙酸类非甾体抗炎药(NSAIDs)，此类药物均具有一个手性中心，只有右旋体才具有抗炎抗风湿和镇痛作用，左旋体几乎没有药理活性且毒副作用大。目前，市售(S)-(+)－酮洛芬主要合成方法有传统的化学合成法、手性拆分以及生物酶合成法。化学合成法主要是不对称合成可通过6步反应，由烯丙醇通过sharpless环氧化制备得到(2S，3S)环氧化合物，再加入手性位移试剂，经过对映体选择性氢解后生成二醇，在RuO4/NaIO4的催化下，最终得到右旋酮洛芬，ee值达到98％这种方法的产率和对映体选择性较为理想，但是均需要用到传统的化学催化剂以促使反应快速进行，而大部分催化剂毒性较高、易燃且会造成环境污染，还有可能引入有害的副产物。另有手性拆分方法，有专利(专利01，CN101928214A)采用国内廉价易得的(-)-葡辛胺作为拆分剂拆分(RS)-酮洛芬，按一定比例混合后升温回流后降温结晶，对酮洛芬利用率达70％。目前也有采用高分子印迹聚合物、色谱法对酮洛芬对映体进行拆分。也有研究利用微生物酶法进行酮洛芬拆分。也有研究利用紫外诱变得到的微生物菌株在一定条件下进行发酵，利用菌体拆分(RS)-酮洛芬。也有研究利用诺维信脂肪酶435催化酮洛芬酯拆分，该研究中，大肠杆菌表达来自于古细菌的嗜热酯酶，利用菌体催化酮洛芬乙酯反应生成右旋酮洛芬。然而，利用酯酶的缺点在于拆分率和产物ee值都不理想，底物浓度偏低问题也难以解决。生物酶合成法可以一定程度是解决底物浓度和产物ee值偏低的问题。目前已有利用腈水合酶和酰胺酶双酶体系制备光学纯酮洛芬的报道。但现有技术的转化率或光学纯度均较低，仍达不到生产要求。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的专利技术人对酰胺酶进行了筛选，发现在特定菌中的酰胺酶对右旋酰胺酮洛芬的特异性识别能力强，右旋酮洛芬的转化率和ee值高。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种用于右旋酮洛芬的合成的酶组合。根据本专利技术的实施例，所述组合包括：腈水合酶和酰胺酶，所述酰胺酶来源于Agrobacterium.。专利技术人发现，来源于Agrobacterium.的酰胺酶对右旋酰胺酮洛芬的特异性识别能力更强，使用腈水合酶和来源于Agrobacterium.的酰胺酶的双酶体系制备右旋酮洛芬，可大大提高右旋酮洛芬的转化率和ee值。根据本专利技术的实施例，上述酶组合还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本年专利技术的实施例，所述酰胺酶具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。MAISRPSVHQLKDMAARLHMTLTTEQASEFLGLMQASFDAYDVVDALPDCVPEVRYPRTPGYRPTGAENEYNAWYRKARVEGSGEGKLAGRTIVLKDNISLAGVPMMNGASTLEGFIPGYDATVVTRMLDAGATIMGKATCEHFCLSGGSHTSDPGPVHNPRRKGRAAGGSSSGSATLVALGEVDMAIGGDQGGSIRIPSAFCGTYGMKPTHGLVPYTGIMPIEATIDHAGPITANVKDNAVLLEVLAGADGLDPRQYALKVEDYASVLNRGIAGMKIAMVKEGFGLANMDARVADKVQEAAATLQSLGATVEEISIPSHAIGPAIWQPIGCEGLTAQMMHGNGMGFNWKGLYDVGLLDAHSAWRERADDLAATLKLCMFVGQYGLDHYRGRYYAKAQNLARMLKADYDASLSEFDLLLMPTVPVVAQPLPEADASLSDYIGRAFEMIANTAPLDITGHPAMSLPCGLVDELPVGLMLVGKHFGESTIYQAAAAFEAGGDWQSM(SEQIDNO:1)。SEQIDNO:1表示来源于Agrobacterium的酰胺酶的氨基酸序列。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种制备右旋酮洛芬的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括使酰胺酮洛芬在酰胺酶的催化下进行脱氨基反应，以便获得右旋酮洛芬，所述酰胺酶来源于Agrobacterium。根据本专利技术实施例的上述制备右旋酮洛芬的方法可表示如下：专利技术人发现，来源于Agrobacterium的酰胺酶对右旋酰胺酮洛芬的特异性识别能力更强，使用来源于Agrobacterium的酰胺酶制备右旋酮洛芬，可大大提高右旋酮洛芬的ee值。根据本专利技术的实施例，上述制备右旋酮洛芬的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述酰胺酶具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。根据本专利技术的实施例，所述酰胺酶是以酰胺酶发酵菌体的形式提供的。根据本专利技术的具体实施例，所述酰胺酶发酵菌体是通过如下方式获得的：将转化有质粒的大肠杆菌菌体进行活化处理，所述质粒中携带表达酰胺酶的核酸序列；将活化处理后菌液进行基础发酵培养，以便获得OD600为30～35的基础发酵培养菌液；将所述基础发酵培养菌液进行诱导培养，所述诱导培养是在IPTG存在的条件下进行的，所述诱导培养的时间为14～16h。根据本专利技术的实施例，所述酰胺酮洛芬与酰胺酶发酵菌体的质量比为(0.5～3)：1，如3：1，2：1，1：1。根据本专利技术的实施例，进一步包括将所述酰胺酶发酵菌体进行干燥处理，以便获得菌体干粉。根据本专利技术的实施例，所述酰胺酮洛芬与酰胺酶发酵菌体干粉的质量比为(2.5～4.5)，如3:1,4:1。进而催化反应效率进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述酰胺酮洛芬是通过使氰基酮洛芬在腈水合酶的催化下进行酰胺化反应获得的。附图说明图1是根据本专利技术实施例的蛋白诱导表达的凝胶电泳图；图2是根据本专利技术实施例5的酰胺酶AMD04菌体催化合成右旋酮洛芬产物样品的HPLC检测结果；以及图3是根据本专利技术实施例6的酰胺酶AMD04干粉催化合成右旋酮洛芬产物样品的HPLC检测结果。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。本专利技术在大肠杆菌中表达酰胺酶AMD04，利用大肠杆菌菌体进行酶催化反应，其中：酰胺酶AMD04氨基酸序列来源于Agrobacterium。利用酰胺酶催化右旋酮洛芬合成的途径为：下面将更加详细地描述本专利技术的实施例。实施例1酰胺酶AMD04大肠杆菌表达菌株构建根据Agrobacterium酰胺酶AMD04氨基酸序列，序列如SEQIDNO:2所示。基因克隆在pET28a的NcoI和HindIII位点，核酸序列根据大肠杆菌密码子进行优化，优化后的核酸序列如下所示，并交由通用生物系统(安徽)有限公司进行合成。AT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于右旋酮洛芬的合成的酶组合，其特征在于，包括：腈水合酶和酰胺酶，所述酰胺酶来源于Agrobacterium.。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于右旋酮洛芬的合成的酶组合，其特征在于，包括：腈水合酶和酰胺酶，所述酰胺酶来源于Agrobacterium.。


2.根据权利要求1所述的酶组合，其特征在于，所述酰胺酶具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。


3.一种制备右旋酮洛芬的方法，其特征在于，使酰胺酮洛芬在酰胺酶的催化下进行脱氨基反应，以便获得右旋酮洛芬，所述酰胺酶来源于Agrobacterium.。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酰胺酶具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。


5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酰胺酶是以酰胺酶发酵菌体的形式提供的。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酰胺酶发酵菌体是通过如下方式获得的：
将转化...

【专利技术属性】
技术研发人员：林洁，王小龙，张枝，杨燕花，麦倩婷，李拓，庞嘉颖，李凯峰，屈代鑫，
申请(专利权)人：东莞市东阳光生物合成药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44