一种合成β-法尼烯的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种合成β‑法尼烯的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术基因工程菌敲除了酿酒酵母中GAL80、ALD6、ALD4、ADH5和RHR2基因，整合了AaFS、LmPK、CkPTA、DzeutE、SpHMGR、GAL4和HMG1基因，其中利用的启动子和终止子分别为P

【技术实现步骤摘要】
一种合成β-法尼烯的基因工程菌及其应用
本专利技术涉及一种合成β-法尼烯的基因工程菌及其应用，属于基因工程

技术介绍
法尼烯(C15H24)，密度0.813g/cm3，是一种无环倍半萜，它由苹果、青蒿等植物中产生来对抗外界昆虫或动物的侵害(Nieuwenhuizenetal.,2014；Yangetal.,2011)，而其吸湿性低和高能量密度的特点使其成为高密度燃料的研究对象。随着合成生物学的不断发展，以微生物作为细胞工厂合成法尼烯成为一种可持续、快速、绿色的生产方法。然而，目前，在微生物细胞中生产法尼烯并不理想，利用微生物生产法尼烯一直缓慢前行，未能实行工业化生产。现有报道中，大肠杆菌作为底盘细胞产生法尼烯发酵生产α-farnesene的产量能够达到380mg/L(Zhuetal.,2014)，生产β-farnesene8.74g/L(Utilizationofbiodieselby-productassubstrateforhigh-productionofβ-farneseneviarelativelybalancedmevalonatepathwayinE.coli)，但是，以质粒形式存在的游离基因在发酵过程中不稳定，易丢失，不利于大规模的发酵生产。除大肠杆菌外，酿酒酵母具有成熟的真核表达系统，拥有天然的甲羟戊酸(MVA)途径，为异源萜类化合物的合成提供了直接前体香叶基焦磷酸(GPP)，因此酿酒酵母细胞具有合成异源萜类化合物的天然优势。目前，其中Chandran等人首先利用酿酒酵母作为生产细胞，异源表达青蒿中β-farnesene合成酶，达到了100g葡萄糖转化成23.8gβ-farnesene的研究(Chandranetal.,2011)；后来，Tippmann等人同样利用酿酒酵母和异源的三个萜品烯合成酶来表达α-farnesene，补料分批培养的产量达到170mg/L(Tippmannetal.,2015)；Adam等人最终通过改造酿酒酵母的代谢平衡将β-farnesene产量提升到110g/L。然而蔗糖价格较高，发酵成本过高，不适于大规模发酵生产，这就限制了其应用。
技术实现思路
为解决低成本生产β-法尼烯的方法，本专利技术提供了一种利用玉米水解液作为培养基，具有β-法尼烯合成能力的基因工程菌及其应用，采用的技术方案如下：第一，本专利技术的目的在于提供能够合成β-法尼烯的基因工程菌，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌敲除了自身的内源基因GAL80、ALD6、ALD4、ADH5和RHR2基因，整合了β-法尼烯合成酶基因AaFS、LmPK、CkPTA、DzeutE、SpHMGR、GAL4和tHMG1基因，所需的启动子和终止子分别为PGAL1，PGAL10，PGAL4和TCYC1，TADH1。所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，基因型为：CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2)。所述法尼烯合成酶基因AaFS是经过密码子优化的，原始法尼烯合成酶基因AaFS来自Artemisiaannua，GenBank登录号为AAX39387.1，优化后的法尼烯合成酶基因AaFS的序列见SEQIDNO.1，所述β-法尼烯合成酶基因AaFS整合在所述出发菌株酵母菌染色体GAL80位点，启动子和终止子分别为PGAL10和TCYC1。所述LmPK基因来自Leuconostocmesenteroides，NCBIaccessionnumberYP_819405.1，所述LmPK基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体ALD6位点，启动子和终止子分别为PGAL10和TCYC1。所述CkPTA基因来自Clostridiumkluyveri，NCBIaccessionnumberYP_001394780.1，所述CkPTA基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体ALD6位点，启动子和终止子分别为PGAL1和TADH1。所述DzeutE基因来自Dickeyazeae，NCBIaccessionnumberWP_012768716.1，所述DzeutE基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体ALD4位点，启动子和终止子分别为PGAL1和TADH1。所述SpHMGR基因来自Silicibacterpomeroyi，NCBIaccessionnumberYP_164994，所述SpHMGR基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体ALD4位点，启动子和终止子分别为PGAL1和TADH1。所述GAL4基因为所述出发菌株酵母菌的内源基因，GenBank登录号为AQN77051.1，所述GAL4基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体RHR2位点，启动子为P(OC)GAL4，终止子为其自身终止子。所述tHMG1基因为所述出发菌株酵母菌的内源基因，GenBank登录号为CAA86503.1，所述tHMG1基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体RHR2位点，启动子为PGAL1，终止子为其自身终止子。第二，本专利技术还提供上述合成β-法尼烯的基因工程菌在合成β-法尼烯中的应用，所述基因工程菌可以利用玉米水解液发酵产法尼烯，方法为：将所述的基因工程菌接种到一级种子培养基，培养后获得二级种子，将所得二级种子接种到二级种子培养基中进行发酵得到β-法尼烯。所述一级种子培养基为YPD培养基，含有20g/L的葡萄糖、10g/L的酵母粉和20g/L的蛋白胨；所述一级种子培养液，OD600为0.5。所述二级种子培养基的制备方法为：称取1500g玉米醪加入60-70℃的水4500mL，搅拌均匀后放置糊化20-120min；加入0.9mL、3万U/mL的耐高温α-淀粉酶，搅拌均匀后在85-90℃下液化1.5h；液化完成后，迅速冷却至60℃，加入3mL、10万U/mL的糖化酶，搅拌均匀后在55-60℃糖化20h；糖化完成后，用滤布过滤，得到澄清溶液，pH自然，105℃灭菌10min，即得到玉米水解液。上述二级种子培养基的配制方法中，各组分用量并非特定值，而是比例关系，即配方中所有组分的用量均为“每1500g玉米醪”对应的用量。所述一级种子培养液接种到二级种子培养基中，接种体积百分比为接种的一级种子培养液占二级种子培养基的10％，振荡发酵培养5-6d。基因工程菌接种到一级种子培养基中后的培养温度为30℃，培养方式为摇瓶培养，转速为150-250rpm；所述发酵，发酵温度为30℃，振荡速度为150-250rpm。其中发酵容器为带挡板三角瓶。待菌体从初状态到对数生长期中期时，加入10％十二烷作为萃取剂。发酵5-6d后吸取上层十二烷有机相，过滤膜过滤后取1μL进行气相检测，根据法尼烯标准曲线得到玉米水解液产法尼烯的产量。第二，本专利技术提供了一种发酵生产β-法尼烯的玉米水解液培养基，其制备方法为：称取1500g玉米醪加入60-70℃的水4500mL，搅拌均匀后放置糊化20-120min；加入0.9mL、3万U/mL的耐高温本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成β-法尼烯的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌敲除了自身的内源基因GAL80、ALD6、ALD4、ADH5和RHR2基因，整合了β-法尼烯合成酶基因AaFS、LmPK、CkPTA、DzeutE、SpHMGR、GAL4和tHMG1基因，所需的启动子和终止子分别为P

【技术特征摘要】
1.一种合成β-法尼烯的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌敲除了自身的内源基因GAL80、ALD6、ALD4、ADH5和RHR2基因，整合了β-法尼烯合成酶基因AaFS、LmPK、CkPTA、DzeutE、SpHMGR、GAL4和tHMG1基因，所需的启动子和终止子分别为PGAL1，PGAL10，PGAL4和TCYC1，TADH1。


2.根据权利要求1所述的合成β-法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，基因型为：CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2)。


3.根据权利要求1所述的合成β-法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述法尼烯合成酶基因AaFS是经过密码子优化的，原始法尼烯合成酶基因AaFS来自Artemisiaannua，GenBank登录号为AAX39387.1，优化后的法尼烯合成酶基因AaFS的序列见SEQIDNO.1，所述β-法尼烯合成酶基因AaFS整合在所述出发菌株酵母菌染色体GAL80位点，启动子和终止子分别为PGAL10和TCYC1；所述LmPK基因来自Leuconostocmesenteroides，NCBIaccessionnumberYP_819405.1，所述LmPK基因整合在所述出发菌株酵母菌染色体ALD6位点，启动子和终止子分别为PGAL10和TCYC1；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海波，刘丽娟，咸漠，齐畅，曹小贺，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37