抗恶性疟原虫HRP-II抗体制造技术

本发明专利技术涉及抗恶性疟原虫HRP‑II抗体。本发明专利技术提供抗恶性疟原虫HRP‑II抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含SEQ ID NO：1‑3所示的氨基酸序列或其变体的重链CDRs，SEQ ID NO：4‑6所示的氨基酸序列或其变体的轻链CDRs。本发明专利技术提供所述抗体的用途以及制备所述抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】
抗恶性疟原虫HRP-II抗体
本专利技术涉及疟原虫抗体、其用途以及制备方法。具体而言，本专利技术涉及恶性疟原虫富组氨酸蛋白-II(Histidine-richproteinII，HRP-II)的抗体，其用于检测或诊断疟疾的用途，以及制备所述抗体的方法。
技术介绍
疟疾(Malaria)是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的一种虫媒传染病。寄生于人体的疟原虫主要有四种：间日疟原虫(Plasmodiumvivax，pv)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum，Pf)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae，pm)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale，po)。恶性疟原虫是常见的感染性疟原虫(75％)，是危害最大的病原体，它感染力强，增殖迅速，症状严重，初次感染者致死率高，由其引起的死亡占感染者死亡总数的95％以上，主要存在于非洲、南美和亚洲的热带地区。恶性疟原虫感染是非洲5岁以下儿童的最主要死亡原因。间日疟原虫是第二常见的疟原虫(20％)，其感染所致症状较轻，但其分布更为广泛，受其威胁的人口大约为26～28.5亿，每年发病超过8000万，主要分布在东南亚、南亚和美洲亚热带地区。WHO建议所有疟疾疑似患者应该即时进行疟疾的检测，疾病的快速、准确诊断对于抗疟药的正确使用，避免耐药株的产生及控制病情恶化、降低死亡率至关重要。疟疾诊断是疟疾防治工作的重点。从检测技术原理上进行归类，目前检测疟原虫的方法可以分为四类。一是显微镜直接检测疟原虫，包括厚血膜和薄血膜，这也是目前临床上疟疾诊断的金标准。但费时，费力，需要熟练的技术人员和一定的实验条件。二是疟原虫核酸检测，检测靶标为疟原虫18S核糖体RNA等特异性核苷酸片段，常用的方法为荧光PCR方法和环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationLAMP)。该类方法虽然灵敏度和特异性高，但需要更复杂的仪器设备和技术条件作为支持，不适合作为疟疾流行区常规的检测手段，难以在基层推广应用。三是检测疟原虫色素，通常采用流式细胞检测技术或质谱方法。该方法需要专业的检测仪器，一般用于实验室研究，不适用现场检测。四是抗原抗体的免疫反应检测疟原虫，方法学上有免疫层析快速诊断试剂(RDT)和酶联免疫吸附(ELISA)，检测的靶抗原大多为LDH、HRP-II等诊断抗原。以抗原为检测目标的RDT应用在恶性疟原虫流行的落后地区具有重要意义，因其操作简便、快速、结果直观，无需复杂设备、敏感性和特异性高等优点，是WHO推荐用于现场诊断的方法。目前，常用的检测疟疾抗原主要为恶性疟原虫特有的富组氨酸蛋白-II(Histidine-richproteinII，HRP-II)和疟原虫乳酸脱氢酶(PlasmodiumLactatedehydiogenase，PLDH)。HRP-II是恶性疟原虫特有的35-105kDa水溶性蛋白质，只在红内期无性体期和早期配子体期合成，合成开始于未成熟的环状体，含量在整个红内期随裂殖子的分裂逐渐升高，能持续28d，对成熟配子体期难以检测到。HRP-II蛋白以可溶形式分泌入宿主血液中，同时该蛋白在脑脊液、尿液及唾液中均可检测到，是最为认可的恶性疟原虫诊断标志物。通过特异的单克隆抗体检测HRP-II可以判断人体内恶性疟原虫的存在。目前，市场上以HRP-II作为靶蛋白用于检测疟原虫的试剂盒有很多，如国外的ParaSight-F试剂盒，ICTMalariaP.f.＆P.f/P.v诊断试剂盒，试剂盒，CareStart疟疾HRP-II/PLDH复合测试盒；国内的有艾康P.f/P.v胶体金免疫层析检测试剂盒等。ParaSight-F试剂盒为世界卫生组织推荐的应用产品，用鼠抗HRP-IIIgG1类单克隆抗体及对照HRP-II抗原以线状和虚线状包被于条形硝酸纤维素膜上分别作为捕获抗体和检测线，以硫代罗丹明B作为指示剂显色，只能检测恶性疟。ICTMalariaP.f/P.v诊断试剂盒在硝酸纤维膜上包被1株抗恶性疟原虫HRP-II单抗和1株间日疟种属特异单抗作为捕获抗体，以胶体金标记进行显色，用于恶性疟、间日疟和混合感染。试剂盒应用了2种不同单克隆抗体，检测靶蛋白是HRP-II和醛缩酶，HRP-II为恶性疟特有，醛缩酶是4种感染人体疟原虫所共有的成分，同时检测单纯恶性疟和除恶性疟外的其他人疟原虫。CareStart疟疾HRP-II/PLDH复合测试盒用2中单克隆单体在膜上形成独立的两条检测线，分别是抗疟原虫属(恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟)的乳酸脱氢酶(PLDH)单抗和抗HRP-II单抗，专用于恶性疟和其他型疟疾的鉴别诊断。艾康P.f/P.v胶体金免疫层析检测试剂盒分别采用抗恶性疟原虫HRP-II和抗间日疟原虫PLDH单抗作捕获抗体，同时诊断单纯恶性疟和单纯间日疟的感染。上述各种试剂盒中，均使用了抗HRP-II单克隆抗体。目前，市场上用于诊断的单克隆抗体的常规制备方法是杂交瘤技术，即利用基因工程技术表达HRP-II蛋白免疫小鼠，将免疫的小鼠脾细胞与瘤细胞融合获得杂交瘤细胞，最后筛选出分泌目标抗体的杂交瘤细胞，然后进行抗体生产。
技术实现思路
本专利技术提供抗恶性疟原虫HRP-II抗体或其抗原结合片段。本专利技术还提供所述抗体的制备方法、包含所述抗体的抗体偶联物、融合蛋白和试剂盒/诊断剂，以及所述抗体用于诊断恶性疟原虫感染的用途。在一些实施方案中，本专利技术提供抗体或其抗原结合片段，所述抗体结合恶性疟原虫富组氨酸蛋白-II，即HRP-II，其中所述抗体包含下述氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性(例如至少81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高序列同一性)的互补决定区：重链CDR1，其包含SEQIDNO：1所示的氨基酸序列G-X1-T-X2-T-X3-Y-Y-M-N，或由其组成，其中X1是Y、T或S；X2是L或I；X3是D或E，优选D；重链CDR2，其包含SEQIDNO：2所示的氨基酸序列D-X1-N-P-I-X2-G-G-T-X3-Y-X4-Q-K-F，或由其组成，其中X1是L、V或I；X2是Q或N；X3是A或P，优选A；X4是Q或N；和重链CDR3，其包含SEQIDNO：3所示的氨基酸序列T-X1-G-A-E-X2-Y，或由其组成，其中X1是K或R；X2是D或E，优选D；并且所述抗体还包含：轻链CDR1，其包含SEQIDNO：4所示的氨基酸序列S-Q-S-X1-Y-S-X2-G-K-I-Y-X3-N，或由其组成，其中X1是LL、IL、II或LI；X2是Q或N；X3是I或L，优选L；轻链CDR2，其包含SEQIDNO：5所示的氨基酸序列Q-X1-S-K-X2-X3-P，或由其组成，其中X1是I、V或L；X2是I或L，优选L；X3是D或E；和轻链CDR3，其包含SEQIDNQ：6所示的序列L-Q-X1-T-Y-X2-P-X3-T，或由其组成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗体或其抗原结合片段，所述抗体结合恶性疟原虫富组氨酸蛋白-II，即HRP-II，其中所述抗体包含下述氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的互补决定区：/n重链CDR1，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列G-X1-T-X2-T-X3-Y-Y-M-N，或由其组成，其中X1是Y、T或S；X2是L或I；X3是D或E，优选D；/n重链CDR2，其包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列D-X1-N-P-I-X2-G-G-T-X3-Y-X4-Q-K-F，或由其组成，其中X1是L、V或I；X2是Q或N；X3是A或P，优选A；X4是Q或N；和/n重链CDR3，其包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列T-X1-G-A-E-X2-Y，或由其组成，其中X1是K或R；X2是D或E，优选D；/n并且所述抗体还包含：/n轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列S-Q-S-X1-Y-S-X2-G-K-I-Y-X3-N，或由其组成，其中X1是LL、IL、II或LI；X2是Q或N；X3是I或L，优选L；/n轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列Q-X1-S-K-X2-X3-P，或由其组成，其中X1是I、V或L；X2是I或L，优选L；X3是D或E；和/n轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6所示的序列L-Q-X1-T-Y-X2-P-X3-T，或由其组成，其中X1是A或G；X2是S、Y或T；X3是Q或N，优选Q；/n例如，所述抗体可以包含含有下表所示的氨基酸残基置换组合的重链CDR1，重链CDR2，重链CDR3，轻链CDR1，轻链CDR2，和轻链CDR3：/ni)所述抗体包含下表所示的氨基酸残基置换组合：/n...

【技术特征摘要】
1.抗体或其抗原结合片段，所述抗体结合恶性疟原虫富组氨酸蛋白-II，即HRP-II，其中所述抗体包含下述氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的互补决定区：
重链CDR1，其包含SEQIDNO：1所示的氨基酸序列G-X1-T-X2-T-X3-Y-Y-M-N，或由其组成，其中X1是Y、T或S；X2是L或I；X3是D或E，优选D；
重链CDR2，其包含SEQIDNO：2所示的氨基酸序列D-X1-N-P-I-X2-G-G-T-X3-Y-X4-Q-K-F，或由其组成，其中X1是L、V或I；X2是Q或N；X3是A或P，优选A；X4是Q或N；和
重链CDR3，其包含SEQIDNO：3所示的氨基酸序列T-X1-G-A-E-X2-Y，或由其组成，其中X1是K或R；X2是D或E，优选D；
并且所述抗体还包含：
轻链CDR1，其包含SEQIDNO：4所示的氨基酸序列S-Q-S-X1-Y-S-X2-G-K-I-Y-X3-N，或由其组成，其中X1是LL、IL、II或LI；X2是Q或N；X3是I或L，优选L；
轻链CDR2，其包含SEQIDNO：5所示的氨基酸序列Q-X1-S-K-X2-X3-P，或由其组成，其中X1是I、V或L；X2是I或L，优选L；X3是D或E；和
轻链CDR3，其包含SEQIDNO：6所示的序列L-Q-X1-T-Y-X2-P-X3-T，或由其组成，其中X1是A或G；X2是S、Y或T；X3是Q或N，优选Q；
例如，所述抗体可以包含含有下表所示的氨基酸残基置换组合的重链CDR1，重链CDR2，重链CDR3，轻链CDR1，轻链CDR2，和轻链CDR3：
i)所述抗体包含下表所示的氨基酸残基置换组合：



ii)i)中的抗体进一步包含下表所示的氨基酸残基置换组合：









其中所述抗体以10-9M或更小的KD结合HRP-II蛋白。


2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
重链CDR1，其包含SEQIDNO：21所示的氨基酸序列或由其组成；
重链CDR2，其包含SEQIDNO：22所示的氨基酸序列或由其组成；和
重链CDR3，其包含SEQIDNO：23所示的氨基酸序列或由其组成；
并且所述抗体还包含：
轻链CDR1，其包含SEQIDNO：24所示的氨基酸序列或由其组成；
轻链CDR2，其包含SEQIDNO：25所示的氨基酸序列或由其组成；和
轻链CDR3，其包含SEQIDNO：26所示的序列或由其组成。


3.权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含重链可变区的框架区FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，和轻链可变区的框架区FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中
FR-H1包含SEQIDNO：27的氨基酸序列，或与SEQIDNO：27所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQIDNO：27所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其列组成；
FR-H2包含SEQIDNO：28的氨基酸序列或与SEQIDNO：28所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQIDNO：28所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
FR-H3包含SEQIDNO：29的氨基酸序列或与SEQIDNO：29所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQIDNO：29所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
FR-H4包含SEQIDNO：30的氨基酸序列，或与SEQIDNO：30所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQIDNO：30所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；和
FR-L1包含SEQIDNO：31的氨基酸序列或与SEQIDNO：31所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQIDNO：31所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
FR-L2包含SEQIDNO：32的氨基酸序列或与SEQIDNO：32所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQIDNO：32所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
FR-L3包含SEQIDNO：33的氨基酸序列或与SEQIDNO：33所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQIDNO：33所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
FR-L4包含SEQIDNO：34的氨基酸序列或与SEQIDNO：34所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQIDNO：34所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。


4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQIDNO：17所示的氨基酸序列，或
与SEQIDNO：17所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或
与SEQIDNO：17所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
(II)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQIDNO：19所示的氨基酸序列，或
与SEQIDNO：19所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或
与SEQIDNO：19所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。


5.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以10-10M或更小的KD结合HRP-II蛋白。


6.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔鹏，何志强，孟媛，钟冬梅，唐丽娜，梁碧，游辉，
申请(专利权)人：东莞市朋志生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44