一种索玛鲁肽前体的制备方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，特别涉及一种索玛鲁肽前体的制备方法，本发明专利技术采用基因重组技术，与化学合成相比，减少了杂质的产生，纯度和收率相对较高；其主要的步骤包括：首先利用基因重组技术将带有GLP‑1(9‑37)基因序列且为串联表达序列的质粒导入到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，构建重组工程菌，经过高密度发酵诱导后获得表达GLP‑1(9‑37)的串联表达蛋白，后进过变性、复性酶切、纯化等步骤后得到索玛鲁肽前体GLP‑1(9‑37)。

【技术实现步骤摘要】
一种索玛鲁肽前体的制备方法
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种索玛鲁肽前体的制备方法。
技术介绍
索玛鲁肽(Semaglutide)是一种通过基因重组技术生产的GLP-1类似物，与人GLP-1具有较高的氨基酸序列同源性，与天然的GLP-1不同的在于索玛鲁肽在人体中的药代动力学以及药效动力学两方面更适用于每周一次的给药方案，其有较高的药物稳定性。当索玛鲁肽药物进行皮下注射后，其主要通过如下机理来延长药物的作用时间：一是通过药物蛋白的交联作用使其吸收能够减慢，二是能够与白蛋白结合，同时对DPP-Ⅳ等酶类等具有较为稳定的防止降解的能力，从而能管理具有较长的血浆内半衰期。在2型糖尿病患者中，其临床给药表现为单次给药索玛鲁肽可以检测到胰岛素分泌率以葡萄糖浓度依赖的模式的增加。目前索玛鲁肽作为新型的GLP-1类似物药物，具有较好的半衰期，能够降低糖尿病患者的给药次数，经济负担以及降低患者的给药痛苦。索玛鲁肽作为胰高血糖素肽GLP-1类似物的较为先进的药物之一，在美国地区作为2型糖尿病患者经二甲双胍单药或其他抗糖尿病口服药物治疗失败后的二三线药物使用。其所展示的多个临床试验研究证明联合不同的口服降糖药可以有效控制血糖，并能够使患者减轻体重、减少收缩压及改善胰岛β细胞功能。索玛鲁肽由诺和诺德公司开发研制，通过基因从组计技术，利用酿酒酵母发酵生产获得索玛鲁肽的结构如下：H-7His-8Aib-9Glu-10Gly-11Thr-12Phe-13Thr-14Ser-15Asp-16Val-17Ser-18Ser-19Tyr-20Leu-21Glu-22Gly-23Gln-24Ala-25Ala-26Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcidMono-tert-butylester)-27Glu-28Phe-29Ile-30Ala-31Trp-32Leu-33Val-34Arg-35Gly-36Arg-37Gly-OH。由以上结构式可知：索玛鲁肽分子式为C187H291N45O59，分子量为4113.57，是在天然GLP-1分子结构上更换了1个氨基酸(第34位的赖氨酸改为了精氨酸)，第8为的丙氨酸改为了非天然氨基酸Aib，并在26位赖氨酸接上AEEA、谷氨酸和十八烷酸脂肪链，即由多肽GLP-1(9-37)，His-Aib和AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcidMono-tert-butylester三部分组成，现有技术中中间体多肽GLP-1(9-37)的合成方法主要采用化学合成添加，但存在收率低，纯度不高的缺点。
技术实现思路
本专利技术解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种索玛鲁肽前体的制备方法；通过基因重组技术，利用大肠杆菌高密度发酵诱导表达获得GLP-1串联表达蛋白包涵体，后经过变复性、酶切、分离等操作获得多肽片段GLP-1(9-37)。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种用于合成索玛鲁肽前体多肽GLP-1的串联形式蛋白，包含SEQIDNo.1所述的氨基酸序列。本专利技术还提供了一种编码所述融合蛋白的基因，包含SEQNo.2所述的DNA序列。本专利技术还提供了一种包含所述编码基因的重组载体，所述重组载体，将所述编码基因插入质粒Pet-27b(+)相应酶切位点。本专利技术还提供一种包含所述编码基因的工程菌。本专利技术还提供了一种利用所述编码基因合成索玛鲁肽前体多肽的方法，包括以下步骤：步骤1，合成编码基因，所述编码基因包含SEQIDNo.2所述的DNA序列，并将该基因序列连接到表达载体pET-27b(+)中，并将含有此编码基因表达载体转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中，构建重组工程菌；步骤2，所筛选的重组工程菌经过发酵诱导表达包涵体形式的串联表达索玛鲁肽前体；步骤3，菌体破碎收集包涵体、包涵体洗涤、变复性经过酶切纯化后获得多肽索玛鲁肽前体GLP-1(9-37)。优选地，将所述步骤1中表达载体的连接方式为：通过NdeI/XhoI酶切位点插入到质粒pET-27b(+)相应酶切位点中。优选地，所述步骤2中重组基因工程菌的发酵采取高密度发酵；具体培养方式为：接种所得基因工程菌于10mLLB培养基中，30℃200rpm振荡过夜培养至OD600＝12～15后，按照0.8％(v/v)比例转接培养后的菌液至100mLLB培养基中，振荡培养至OD600＝4时将摇瓶培养菌种接入到2.5L的发酵培养基中进行高密度发酵罐培养；初始发酵温度为30℃，搅拌速度200rpm，通气量为2L/min，pH为6.7，之后随着培养提高搅拌转速与通气量最大分别至800rpm和8L/min以维持培养过程中的溶解氧始终保持在30％以上，搅拌转速和空气流量达到上线后，溶解氧快速上升后，开始流加补料，此时培养pH为6.9，当补料6h后，控制温度30℃，加入异丙基硫代半乳糖苷进行8h的补料诱导后离心获取菌体。优选地，所述步骤3的具体步骤为：将串联表达的索玛鲁肽前包涵体用0.5MTris-HClpH8.5的缓冲液搅拌均匀后加入0.5％的SDS以及1％的TritonX-100，室温下用磁力搅拌器搅拌3-4小时，使沉淀缓慢溶解；4℃，10000rpm离心10min，弃沉淀；将所得上清使用使用去离子水稀释10倍，然后使用0.22μm微孔滤膜过滤后得到可溶性蛋白；复性后的可溶蛋白经过KEX2酶以及羧肽酶B(1:100)在室温下酶解16h后即可得到索玛鲁肽前体的混合液。混合液使用阴离子交换以及反向填料分离即可获得纯化符合要求的索玛鲁肽前体。阴离子纯化条件：缓冲液A-25mMTris-HClpH8.5，缓冲液B-A+1MNaCl,线性梯度洗脱20CV。反相纯化的纯化条件：缓冲液A-50mM磷酸三乙胺缓冲液pH2.17，缓冲液B-ACN，线性梯度洗脱8CV。相对于现有技术，本专利技术的优点如下，本专利技术是索玛鲁肽前体体外原核表达实践中的一种技术革新，具体涉及一种索玛鲁肽前体蛋白原核串联表达包涵体的变复性方法，其能够有效提升包涵体的变复性效率达95％以上并获得可溶性蛋白；本专利技术利用棉麻基因合成索玛鲁肽前体的串联表达方法，收率高、纯度高。附图说明图1是诱导前后电泳图；图中，泳道1：重组蛋白高密度发酵诱导前；2：重组蛋白高密度发酵诱导2h；3：重组蛋白高密度发酵诱导4h；4：重组蛋白高密度发酵诱导6h；5：重组蛋白高密度发酵诱导8h；6：重组蛋白高密度发酵诱导10h；图2是酶切前后电泳图；图中，泳道1：串联表达蛋白复性产物；2：复性蛋白KEX2/CPB酶切产物；图3是酶切前HPLC检测图；图4是酶切后HPLC检测图；图5是酶切后混合液阴离子纯化图谱；图6是阴离子纯化HPLC检测图；图7是酶切后反相纯化图谱；图8是反相纯化HPLC检测图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，其特征在于，包含如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，其特征在于，包含如SEQIDNo.1所述的氨基酸序列。


2.一种编码如权利要求1所述蛋白质的编码基因，其特征在于，包含如SEQIDNo.2所述的DNA序列。


3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组载体。


4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，将所述编码基因插入质粒pET-27b(+)相应的酶切位点中。


5.一种包含如权利要求2所述编码基因的重组工程菌。


6.权利要求2所述编码基因在合成索玛鲁肽中间体多肽中的应用。


7.权利要求6中所述的应用，其特征在于，包含如下步骤：
(1)合成编码基因，所述编码基因包含SEQIDNo.2所述的DNA序列；
(2)将编码基因连接到表达载体中；
(3)将带有编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，构建重组工程菌；
(4)重组工程菌发酵诱导表达以包涵体形式存在的串联表达蛋白，所述串联表达蛋白包含SEQIDNo.1所述的氨基酸序列；
(5)菌体破碎收集包涵体、包涵体洗涤、变性和复性；
(6)酶切、分离纯化获得索玛鲁肽前体GLP-1(9-37)...

【专利技术属性】
技术研发人员：文良柱，韩宇鹏，辛中帅，赵珊珊，平康康，陈慧梅，张明义，王玉刚，杨桦，赵梅，
申请(专利权)人：万新医药科技苏州有限公司，江苏万邦医药科技有限公司，江苏万邦生化医药集团有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32