小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，特别涉及一种小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白及其制备方法和应用，所述亚单位F蛋白的氨基酸序列为：①如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；②由SEQ ID NO.1经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有免疫原性的衍生的氨基酸序列。本发明专利技术的亚单位F蛋白主要通过构建重组质粒、重组质粒转染细胞株、筛选高表达的细胞株、纯化小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白制备而成，能较好的适用于小反刍兽疫病毒的亚单位疫苗或诊断试剂中，具有分泌表达高效、蛋白纯度高、易于纯化、生产成本降低、安全性能高等特点。

【技术实现步骤摘要】
小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于动物疫苗与兽用生物制品
，特别涉及小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
小反刍兽疫(PestedesPetitsofRuminats，PPR)是由小反刍兽疫病毒(PestedesPetitsofRuminatsVirus，PPRV)引起的一种烈性、接触性传染的病毒性疾病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病，我国也将其列为一类疫病。PPRV主要感染羊，特别是山羊高度易感。一旦感染羊会以突然发热、精神沉郁、口腔溃疡、咳嗽，眼和鼻排出分泌物、腹泻为特征，发病率和死亡率可达100％，造成巨大经济损失，严重影响养羊业的发展。目前对该病尚无有效的治疗手段，主要依靠疫苗进行防控。由于PPRV和牛瘟(RPV)两种病毒同属，且抗原存在交叉反应性，因此历史上曾用RPV弱毒苗进行PPRV的预防，但该疫苗可导致RPV检测假阳性，不利于国家牛瘟消灭计划的实施，故现已停止使用。目前预防该病的发生主要是通过弱毒疫苗，该疫苗是通过常规手段在Vero细胞中连续传代致弱获得，疫苗持续期长，免疫动物安全。但该疫苗是常规致弱的活疫苗在大面积使用过程中，有可能与同源的强毒株发生重组，毒力变强或出现新型毒株，造成免疫失败，甚至引起新的疫情发生。此外，该疫苗免疫动物后，不能通过血清学手段区分免疫动物和自然感染动物，故既不利于PPR疫情的检测，也不利于PPR消灭计划的实施。PPRV属于副粘病毒科麻疹病毒属，病毒粒子成椭圆形或圆形，病毒粒子的最外层包裹有囊膜，囊膜上有突出的纤突。PPRV基因组为单股负链不分节段RNA，全长约15.6kb，基因组依次编码衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)、大蛋白(L)六个结构蛋白和C、V两种非结构蛋白。其中F蛋白和H蛋白是病毒囊膜的主要蛋白，能够刺激机体产生中和抗体，是亚单位疫苗的首选糖蛋白。亚单位疫苗不含有核酸物质，接种后不会产生持续感染或潜伏感染；产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。但是亚单位疫苗也有明显的缺陷：生产成本高，应用受到限制。亚单位疫苗的成本主要在亚单位蛋白的生产上，F蛋白是囊膜糖基化修饰三聚体蛋白。一般由537-552个氨基酸组成，这时的F蛋白并不具备完整的生物功能，称之为蛋白F0，为了获得具有生物活性的亚单位F蛋白，F0需要被细胞蛋白酶水解成一个靠二硫键连接的多肽F1和F2。因此，为了保证表达蛋白能够有糖基化修饰和形成完整活性的F1和F2，必须在动物细胞中才能实现。工程化细胞是目前生物制药工程上广泛使用的表达细胞。在该系统表达的蛋白在分子结构、理化特性和转录后修饰等生物学功能方面最接近于天然蛋白分子。且能以悬浮培养方式达到高密度培养，且培养体积能达到2,000L以上，可以大规模生产。然而，在使用工程化细胞表达F蛋白时，F蛋白的编码基因序列未经优化时，工程化细胞基本不表达F蛋白，进而难以获得具有优良免疫原性和稳定性的F蛋白以供小反刍兽疫病毒的防控，因此，在使用工程化细胞表达F蛋白时，对F蛋白的编码基因序列进行优化是一个必须的过程。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白，其亚单位F蛋白具有小反刍兽疫病毒F蛋白优良的免疫原性和稳定性，同时便于在工程化细胞株中稳定高效的分泌表达。本专利技术的第二个目的在于提供一种小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白的制备方法，便于亚单位F蛋白的大规模工业化生产，降低了F蛋白的生产成本。本专利技术的第三个目的在于提供一种小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白的应用，能够较好的应用于小反刍兽疫病毒的亚单位疫苗和诊断试剂中，从而便于人们对小反刍兽疫病毒的防控。为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白，所述亚单位F蛋白的氨基酸序列：①如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；②由SEQIDNO.1经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有免疫原性的衍生的氨基酸序列。根据本专利技术的技术方案，优先地，在如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。根据本专利技术的技术方案，优先地，所述亚单位F蛋白的编码基因序列由如SEQIDNO.2所示，或由SEQIDNO.2经密码子优化后所得。根据本专利技术的技术方案，优先地，所述亚单位F蛋白的编码基因序列如SEQIDNO.3所示。为实现上述第二个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白的制备方法，包括以下步骤：①、构建小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白的编码基因序列；②、将亚单位F蛋白的编码基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有亚单位F蛋白编码基因序列的重组质粒；③、将含有亚单位F蛋白编码基因序列的重组质粒转染至动物的工程化细胞中，得到细胞株；④、从步骤③得到的细胞株中筛选出高度表达的细胞株；⑤、发酵培养步骤④中得到的高度表达的细胞株，纯化后得到小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白。本专利技术的技术方案中，优选地，步骤②中，所述真核表达载体为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13和pcDNA3.1中的一种。本专利技术的技术方案中，优选地，步骤②中，所述真核表达载体为pEE12.4。本专利技术的技术方案中，优选地，步骤③中，所述细胞株为CHO细胞株、HEK293细胞株、293T/17细胞株的一种。本专利技术的技术方案中，优选地，步骤③中，所述CHO细胞株为DG44细胞株、DXB11细胞株、CHO-K1细胞株和CHO-S细胞株的一种。为实现上述第二个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白的应用，所述亚单位F蛋白适用于小反刍兽疫病毒的亚单位疫苗或诊断试剂中。本专利技术提供了第一种亚单位F蛋白，具有小反刍兽疫病毒F蛋白优良的免疫原性和稳定性，同时便于在工程化细胞株中稳定高效的分泌表达，其产量高且易于纯化，在细胞培养上清中的目的蛋白纯度都能达到70％以上，只需一步亲和层析就能使目的蛋白纯度达到90％以上，远远满足亚单位疫苗和诊断试剂的需求，同时便于大规模生产，由此，解决了小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白生产成本高的技术问题。另外，由于生产用的CHO细胞株、HEK293细胞株、293T/17细胞株等工程化细胞株在培养时可控制性高、质控容易、生产蛋白批次间稳定，因此本专利技术生产的小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白中其他病毒量少，有效降低了散毒的风险，具有优异的生物安全性。附图说明图1表示预测的亚单位F蛋白的三维结构模式图；图2表示亚单位F基因序列优化前后比对结果；图3表示pEE12.4-OPTI-F质粒图谱；图4表示pEE12.4-OPTI-F双酶切鉴定结果：M是DNAMarker：DL10000M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白，其特征在于，所述亚单位F蛋白的氨基酸序列为：/n①如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；/n②由SEQ ID NO.1经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有免疫原性的衍生的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白，其特征在于，所述亚单位F蛋白的氨基酸序列为：
①如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
②由SEQIDNO.1经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有免疫原性的衍生的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白，其特征在于，在如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。


3.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白，其特征在于，所述亚单位F蛋白的编码基因序列由如SEQIDNO.2所示，或由SEQIDNO.2经密码子优化后所得。


4.根据权利要求3所述的小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白，其特征在于，所述亚单位F蛋白的编码基因序列如SEQIDNO.3所示。


5.权利要求1-4中任意一项所述的小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①、构建小反刍兽疫病毒的亚单位F蛋白的编码基因序列；
②、将亚单位F蛋白的编码基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有亚单位F蛋白编码基因序列的重组质粒；
③、将含有亚单位F蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱泓，吴有强，卞广林，张强，徐玉兰，吴素芳，车影，
申请(专利权)人：浙江海隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33