一种用于大规模干细胞培养的纳米海藻糖3D微胶囊制造技术

本发明专利技术提供了一种用于大规模干细胞培养的纳米海藻糖3D微胶囊，该3D微胶囊的制备方法包括以下步骤：(1)将重量百分比为1‑6wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为0.1‑5wt％的明胶溶液以0.1‑2:0.1‑2的比例混合均匀，制得第一混合溶液；(2)在第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，起泡剂在第一混合溶液中的浓度为5‑100g/L，制得第二混合溶液；(3)在第二混合溶液中滴加CaCl

【技术实现步骤摘要】
一种用于大规模干细胞培养的纳米海藻糖3D微胶囊
本专利技术属于干细胞
，特别涉及一种用于大规模干细胞培养的纳米海藻糖3D微胶囊。
技术介绍
干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞，干细胞的用途非常广泛，涉及到医学的多个领域，人体的衰老、皱纹的出现，究其根源实质上都是细胞的衰老和减少，而细胞的衰老和减少则是由干细胞老化引起的，干细胞是各种组织细胞更新换代的种子细胞，是人体细胞的生产厂，干细胞族群的老化严重减弱了其增殖和分化的能力，新生的细胞补充不足，衰老细胞不能及时被替代，全身各系统功能下降，让人一天天老去，而皮肤也因为皮肤干细胞的衰老而无法及时更新，衰老的皮肤得不到修复，所以，有了皱纹，失去了青春容颜，干细胞美容原理是通过输注特定的多种细胞(包括各种干细胞和免疫细胞)，激活人体自身的“自愈功能”，对病变的细胞进行补充与调控，激活细胞功能，增加正常细胞的数量，提高细胞的活性，改善细胞的质量，防止和延缓细胞的病变，恢复细胞的正常生理功能，从而达到疾病康复、对抗衰老的目的，但干细胞移植面临两大难题：干细胞移植成活率低和干细胞有效分化率低，这严重阻碍了干细胞治疗的进行。目前国内外存在着一种微胶囊技术，可以使干细胞存活增殖，微胶囊技术很早就被应用在了细胞培养和移植领域，相较于传统培养方式，微胶囊所构建的三维微环境和真实机体环境更加相似，大量的研究表明这种体系可以为胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞和造血干细胞等细胞类型提供良好的体外扩增环境。微胶囊是以天然或合成高分子为材料制作的球形小囊，直径依不同需求可做成几到几千微米，微胶囊可以包封气体、固体或液体物质，可以使物质与环境隔绝而减少来自环境的影响，起到屏蔽物质颜色、味道和气味或控制释放活性物质等功能，构成微胶囊的材料被称为壁材，内部包囊的物质被称为芯材，起隔离作用的壁材依据其通透性可分为不透微胶囊和半透性微胶囊，不透微胶囊一般用于非生物领域，壁材厚，芯材与外部环境完全隔离，需要时往往通过机械或化学的方法使微胶囊破裂，芯材被释放，与环境发生作用，在生物医学领域则主要应用半透性微胶囊，半透性微胶囊一方面要保持其隔离性能，起到储库的作用，一些大分子不允许通过，又要保证一些小分子物质可以任意进出，微胶囊的膜厚度、表面结构、多孔性和芯材分布等物理性质是决定芯材缓释性能的主要因素。随着微胶囊研究的不断发展，为了满足不同应用场合下的性能要求，人们开发了越来越多的成囊技术，更多的新材料也被陆续用于微胶囊的制备，目前生物医学领域研究最深入的材料为海藻酸钠、聚氨基酸和壳聚糖。海藻酸钠被作为微胶囊制备材料而被广泛应用是因为它有一些独特性质，在水溶液状态下，单纯的海藻酸钠以溶胶的形式存在，而当其遇到Ca2+、Ba2+等二价阳离子时，原本与海藻酸根结合的Na+会被逐渐置换出来，形成一种既有一定强度又有一定弹性的凝胶结构。根据专利CN201510920872，大连化物所曾研究过海藻酸盐—壳聚糖酰基衍生物微胶囊，这个胶囊的特点是强度较好，生物相容性好，但是通透性和降解性较差；主要问题是：(1)细胞很快在囊内死亡；(2)微胶囊降解困难。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供了一种用于大规模干细胞培养的纳米海藻糖3D微胶囊。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供了一种用于大规模干细胞培养的纳米海藻糖3D微胶囊，该3D微胶囊的制备方法包括以下步骤：(1)将重量百分比为1-6wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为0.1-5wt％的明胶溶液以0.1-2:0.1-2的比例混合均匀，制得第一混合溶液；(2)在第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，起泡剂在第一混合溶液中的浓度为5-100g/L，制得第二混合溶液；(3)在第二混合溶液中滴加CaCl2溶液，CaCl2溶液与第一混合溶液的体积比为1-2:1-2，制得微胶囊溶液；(4)将微胶囊溶液用生理盐水洗涤3-6次，在进行真空干燥，制得干燥微胶囊；(5)将干燥微胶囊压扁、灭菌，即得3D微胶囊。其中，以上方法中的步骤(2)加入起泡剂后会形成具有丰富气泡结构的溶液；最终生成的微胶囊中富含气泡，本专利技术提供的微胶囊是直径大小为0.5-10毫米的蜂巢结构，微胶囊内部的孔径为10nm到10000nm，本专利技术提供的3D微胶囊支持多种贴附依赖性细胞(贴壁细胞)、兼性贴壁细胞等绝大多数细胞类型的高效生产和收获，包括：成纤维型细胞(内皮细胞、间充质细胞、成骨细胞、心肌细胞、软骨细胞等)、上皮型细胞(皮肤细胞、表皮衍生物、消化管上皮细胞等)、游走型细胞(巨噬细胞、肿瘤细胞等)、多形性型细胞(神经元细胞、神经胶质细胞等)等；本专利技术提供的3D微胶囊的使用方法如下：首先将微胶囊称重，按照1g对应10ml培养基的比例加入DMEM/F12培养基中静置4h完全溶胀。溶胀后将微胶囊转移到含10％FBS的DMEM/F12培养基中，按照5000-10000个细胞/ml的密度接种，采取波动培养的方式经行接种及培养，放置在37℃二氧化碳培养箱中培养，补充培养基，培养完成后，用溶解剂解囊，溶解剂为氨基酸+柠檬酸+柠檬酸钠+EDTA钠盐，其中，氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、氨基酸、精氨酸和组氨酸中的任意一种，氨基酸、柠檬酸、柠檬酸钠、EDTA钠盐的比例：0.1-1.0:0.1-2.0:0.1-1.0:0.1-2.0，收获细胞，计数、对比，本专利技术提供的3D微胶囊可实现干细胞三维大规模增殖，生产收获过程无酶化、快速便捷，对干细胞基本没有伤害，如图1所示，先在3D微胶囊上接种干细胞，然后干细胞在3D微胶囊中大规模增殖，培养完成后进行解囊，收集干细胞即可。进一步地，步骤(5)的将干燥微胶囊压扁是通过机械压扁的方法将干燥微胶囊压扁。进一步地，步骤(5)的将干燥微胶囊压扁、灭菌是采用放射性同位素放射的γ射线杀灭微生物和芽孢，其中，辐射灭菌剂量为25000Gy。进一步地，起泡剂包括氨基酸起泡剂、椰油起泡剂、柠檬酸、柠檬酸钠、碳酸钠和碳酸氢钠中的一种。进一步地，步骤(3)真空干燥是将洗涤后的微胶囊用真空干燥机进行干燥，真空干燥机使用时的参数为：。进一步地，步骤(3)的CaCl2溶液的滴加速度为5-10s/d，。进一步地，步骤(3)的CaCl2溶液前保持第二混合溶液的气泡大小稳定。进一步地，CaCl2溶液的浓度为0.1-0.6mol/L。本专利技术还提供了一种3D微胶囊的用途，用于三维培养大规模的干细胞本专利技术提供的3D微胶囊是一种水凝胶，能允许水和小分子通过，但孔径不足以让细胞通过，具有光学透明、直径0.5-10毫米的特性，使用本专利技术提供的3D微胶囊培养细胞，在5天可使细胞增殖500倍左右，7天可使细胞增殖1000倍左右，收获时细胞活率能达到90％以上；且溶胀时可直接用培养基进行溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于大规模干细胞培养的纳米海藻糖3D微胶囊，其特征在于，所述3D微胶囊的制备方法包括以下步骤：/n(1)将重量百分比为1-6wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为0.1-5wt％的明胶溶液以0.1-2:0.1-2的比例混合均匀，制得第一混合溶液；/n(2)在所述第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，所述起泡剂在所述第一混合溶液中的浓度为5-100g/L，制得第二混合溶液；/n(3)在所述第二混合溶液中滴加CaCl

【技术特征摘要】
1.一种用于大规模干细胞培养的纳米海藻糖3D微胶囊，其特征在于，所述3D微胶囊的制备方法包括以下步骤：
(1)将重量百分比为1-6wt％的海藻酸钠溶液与重量百分比为0.1-5wt％的明胶溶液以0.1-2:0.1-2的比例混合均匀，制得第一混合溶液；
(2)在所述第一混合溶液中加入起泡剂混合均匀，所述起泡剂在所述第一混合溶液中的浓度为5-100g/L，制得第二混合溶液；
(3)在所述第二混合溶液中滴加CaCl2溶液，所述CaCl2溶液与所述第一混合溶液的体积比为1-2:1-2，制得微胶囊溶液；
(4)将所述微胶囊溶液用生理盐水洗涤3-6次，在进行真空干燥，制得干燥微胶囊；
(5)将所述干燥微胶囊压扁、灭菌，即得3D微胶囊。


2.如权利要求1所述的用于大规模干细胞培养的纳米海藻糖3D微胶囊，其特征在于，步骤(5)所述的将所述所述干燥微胶囊压扁是通过机械压扁的方法将所述干燥微胶囊压扁。


3.如权利要求1所述的用于大规模干细胞培养的纳米海藻糖3D微胶囊，其特征在于，步骤(5)所述的将所述所述干燥微胶囊压扁、灭菌是采用放射性同位素放射的γ射线杀灭微生物和芽孢，其中，辐射灭菌剂量为25000Gy。


4.如权利要求1所述的用于大规模干细胞培养的纳米海藻糖3D微胶囊，其特征在于，所述起泡剂包括氨基酸起泡剂、椰油起泡剂、柠檬酸、柠檬酸钠、...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭学锋，曹毓琳，腾睿頔，严咏，王颖，贺伟，白志惠，赵宇红，
申请(专利权)人：北京唐颐惠康生物医学技术有限公司，南京大学，北京臻溪谷医学研究中心有限合伙，
类型：发明
国别省市：北京;11