具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体制造技术

本文公开了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、编码其的核酸以及与其生产和使用有关的组合物和方法，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包括与一种或多种参比枯草杆菌蛋白酶相比具有改善的稳定性的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。

Bacillus subtilis protease variants with improved stability

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体本文公开了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、以及与其生产和使用有关的组合物和方法，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包括与一种或多种参比枯草杆菌蛋白酶相比具有改善的稳定性和/或污垢去除性的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。本申请要求2017年11月29日提交的美国申请号62/591976的权益，其全部内容通过引用并入本文。以电子方式提交的序列表的引用该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为20181128_NB41389PCT_ST25_Final.txt，创建于2018年11月28日，且具有51千字节大小，并与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
技术介绍
蛋白酶(也称为朊酶)是指具有分解其他蛋白质的能力的酶蛋白质。蛋白酶具有通过在形成蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键的水解进行蛋白水解的能力。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为蛋白水解活性。存在许多众所周知的测量蛋白水解活性的方法(Kalisz,“MicrobialProteinases,[微生物蛋白酶]”Fiechter(编),AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology[生化工程/生物技术进展],(1988))。例如，蛋白水解活性可以通过分析各个蛋白酶水解商业底物的能力的比较测定来确定。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(西格玛公司(Sigma)C-9801)、牛胶原(西格玛公司(Sigma)C-9879)、牛弹性蛋白(西格玛公司(Sigma)E-1625)和牛角蛋白(ICN生物医学公司(ICNBiomedical)902111)。使用这些底物的比色测定是本领域熟知的(参见例如WO99/34011和美国专利号6,376,450，这两者都通过引用并入本文)。丝氨酸蛋白酶是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶(EC编号3.4.21)。丝氨酸蛋白酶包含种类繁多的具有广泛特异性和生物学功能的酶，基于这些酶的结构，这些酶被进一步划分为胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶样。原型枯草杆菌蛋白酶(EC编号3.4.21.62)最初从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)获得。枯草杆菌蛋白酶(有时也称为枯草杆菌酶)及其同源物是MEROPS分类方案的S8肽酶家族的成员。S8家族的成员在其氨基酸序列中具有顺序为Asp、His和Ser的催化三联体。尽管已经开发了许多可用于清洁应用的变体蛋白酶，但是仍然需要改善的枯草杆菌蛋白酶变体。
技术实现思路
在一个实施例中，本公开提供了一种或多种与SEQIDNO:1具有至少50％氨基酸序列同一性的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述多肽相对于SEQIDNO:1具有以下特征中的至少三个：在位置3处的Q、T或V；在位置9处的E；在位置24处的Q；在位置40处的E；在位置69处的S；在位置76处的D；在位置78处的N；在位置87处的D；在位置118处的R；在位置124处的I；在位置128处的Q、R或S；在位置129处的P；在位置130处的S；在位置145处的R；在位置166处的Q；在位置182处的E；在位置185处的Q；在位置210处的I；在位置211处的P；在位置217处为L或Q；在位置218处的S；在位置248处的D；以及在位置259处的P，其中所述氨基酸位置与SEQIDNO:1相对应编号，并且其中所述变体不具有与天然存在的分子相同的氨基酸序列。其他实施例涉及相对于SEQIDNO:1具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶变体：在位置3处的Q、T或V；在位置9处的E；在位置24处的Q；在位置40处的E；在位置69处的S；在位置76处的D；在位置78处的N；在位置87处的D；在位置118处的R；在位置124处的I；在位置128处的Q、R或S；在位置129处的P；在位置130处的S；在位置145处的R；在位置166处的Q；在位置182处的E；在位置185处的Q；在位置210处的I；在位置211处的P；在位置217处为L或Q；在位置218处的S；在位置248处的D；以及在位置259处的P，其中所述氨基酸位置与SEQIDNO:1相对应编号，其中所述变体衍生自与SEQIDNO:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的亲本多肽或参比多肽。仍其他实施例涉及相对于SEQIDNO:1具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶变体：在位置3处的Q、T或V；在位置9处的E；在位置24处的Q；在位置40处的E；在位置69处的S；在位置76处的D；在位置78处的N；在位置87处的D；在位置118处的R；在位置124处的I；在位置128处的Q、R或S；在位置129处的P；在位置130处的S；在位置145处的R；在位置166处的Q；在位置182处的E；在位置185处的Q；在位置210处的I；在位置211处的P；在位置217处为L或Q；在位置218处的S；在位置248处的D；以及在位置259处的P，其中所述氨基酸位置与SEQIDNO:1相对应编号，其中所述变体包含与SEQIDNO:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。另一个实施例涉及改善枯草杆菌蛋白酶分子的稳定性的方法，其中所述方法包括将至少一个取代引入编码枯草杆菌蛋白酶多肽的多核苷酸中，所述取代产生具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶多肽：在位置3处的Q、T或V；在位置9处的E；在位置24处的Q；在位置40处的E；在位置69处的S；在位置76处的D；在位置78处的N；在位置87处的D；在位置118处的R；在位置124处的I；在位置128处的Q、R或S；在位置129处的P；在位置130处的S；在位置145处的R；在位置166处的Q；在位置182处的E；在位置185处的Q；在位置210处的I；在位置211处的P；在位置217处为L或Q；在位置218处的S；在位置248处的D；以及在位置259处的P，其中所述氨基酸位置与SEQIDNO:1相对应编号，并且其中所述变体不具有与天然存在的分子相同的氨基酸序列。又另一个实施例涉及包含至少一种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物，其中所述至少一种枯草杆菌蛋白酶变体与SEQIDNO:1具有至少50％的氨基酸序列同一性，其中所述多肽相对于SEQIDNO:1具有以下特征中的至少三个：在位置3处的Q、T或V；在位置9处的E；在位置24处的Q；在位置40处的E；在位置69处的S；在位置76处的D；在位置78处的N；在位置87处的D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与BPN`(SEQ ID NO:1)具有至少50％氨基酸序列同一性的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体具有选自由以下组成的组的至少三个特征：在位置3处的Q、T或V；在位置9处的E；在位置24处的Q；在位置40处的E；在位置69处的S；在位置76处的D；在位置78处的N；在位置87处的D；在位置118处的R；在位置124处的I；在位置128处的Q、R或S；在位置129处的P；在位置130处的S；在位置145处的R；在位置166处的Q；在位置182处的E；在位置185处的Q；在位置210处的I；在位置211处的P；在位置217处为L或Q；在位置218处的S；在位置248处的D；以及在位置259处的P；其中所述位置与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应编号。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171129 US 62/591,9761.一种与BPN`(SEQIDNO:1)具有至少50％氨基酸序列同一性的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体具有选自由以下组成的组的至少三个特征：在位置3处的Q、T或V；在位置9处的E；在位置24处的Q；在位置40处的E；在位置69处的S；在位置76处的D；在位置78处的N；在位置87处的D；在位置118处的R；在位置124处的I；在位置128处的Q、R或S；在位置129处的P；在位置130处的S；在位置145处的R；在位置166处的Q；在位置182处的E；在位置185处的Q；在位置210处的I；在位置211处的P；在位置217处为L或Q；在位置218处的S；在位置248处的D；以及在位置259处的P；其中所述位置与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对应编号。


2.如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体具有选自由以下组成的组的至少三个特征：在位置3处的T或V；在位置9处的E；在位置40处的E；在位置69处的S；在位置76处的D；在位置78处的N；在位置118处的R；在位置124处的I；在位置128处的Q或S；在位置129处的P；在位置130处的S；在位置145处的R；在位置166处的Q；在位置185处的Q；在位置217处的L；在位置218处的S；在位置248处的D；以及在位置259处的P；其中所述位置与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对应编号。


3.如权利要求2所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体具有选自由以下组成的组的至少三个特征：在位置3处的V；在位置40处的E；在位置69处的S；在位置76处的D；在位置78处的N；在位置118处的R；在位置128处的Q或S；在位置129处的P；在位置145处的R；在位置166处的Q；在位置185处的Q；在位置218处的S；在位置248处的D；以及在位置259处的P；其中所述位置与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对应编号。


4.如权利要求3所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述至少三个特征是选自以下的取代：在位置3处的V；在位置40处的E；在位置69处的S；在位置76处的D；在位置78处的N；在位置118处的R；在位置128处的Q或S；在位置129处的P；在位置145处的R；在位置166处的Q；在位置185处的Q；在位置218处的S；在位置248处的D；以及在位置259处的P；其中所述位置与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对应编号。


5.如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体相对于SEQIDNO:1具有以下特征中的至少三个：在位置3处的Q；在位置24处的Q；在位置87处的D；在位置128处的R；在位置182处的E；在位置210处的I；在位置211处的P；以及在位置217处的Q，其中所述位置与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对应编号。


6.如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体相对于SEQIDNO:1具有以下特征中的至少三个：在位置9处的E；在位置40处的E；在位置76处的D；在位置128处的R；在位置166处的Q；在位置182处的E；以及在位置218处的S，其中所述位置与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对应编号。


7.如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体衍生自与SEQIDNO:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的亲本多肽或参比多肽。


8.如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含与SEQIDNO:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。


9.一种枯草杆菌蛋白酶变体，其具有的多肽序列与BPN`(SEQIDNO:1)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的氨基酸序列同一性，其中所述多肽具有选自由S003Q/V、S009E、S024Q、P040E、A069S、N076D、S078N、S087D、N118R、M124I、G128S、S145R、G166Q、S182E、Y217L/Q、N218S和D259P组成的组的至少三个特征，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对应编号。


10.一种枯草杆菌蛋白酶变体，其具有的多肽序列与AprL(SEQIDNO:15)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的氨基酸序列同一性，其中所述多肽具有选自由T003V、P009E、A069S、T078N、S087D、M124I、G128Q/R/S、A129P、G166Q、S182E、N185Q、P210I、T211P、L217Q、N218S和S259P组成的组的至少三个特征，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置与SEQIDNO:1的氨基酸序列相对应编号。


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【专利技术属性】
技术研发人员：L·M·巴别，V·Y·阿列克谢耶夫，J·R·巴斯勒，H·B·恩金，D·A·埃斯特尔，R·S·吉尔尼卡，F·格德埃格伯，T·卡佩尔，S·普莱斯鲁斯，G·沃格特恩坦茨，M·哈姆，T·桑德范斯蒂格特，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国;US