一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi‑C测序文库的构建方法，属于植物三维基因组技术领域，将植物组织交联，浆状，过滤，将滤液与SDS混合，水浴，与Triton X‑100混合，离心，将细胞核与体系混合，酶切，将酶切物与linker连接，离心，重悬细胞核于体系，水浴后与连接体系混合临近连接，离心，将细胞核与解交联体系混合，解交联，纯化，将DNA与预处理后的链霉亲和素磁珠孵育，将磁珠与Tn5转座酶体系混合酶切加接头，洗去背景，扩增，富集DNA片段，得到测序文库。采用本发明专利技术提供的方法在以玉米为测试对象时，产生的高通量数据在数据信噪比和染色质交互鉴定上具有较强的优势。

【技术实现步骤摘要】
一种简便有效的植物长片段insituDLOHi-C测序文库的构建方法
本专利技术属于植物三维基因组
，尤其涉及一种简便有效的植物长片段insituDLOHi-C测序文库的构建方法。
技术介绍
染色质作为真核生物遗传信息的携带者，并不是随机分布于细胞核中，其空间组织形态在DNA复制，DNA损伤修复和基因的转录调控中扮演着重要的角色。3C(染色质构象捕获)技术在2002年被首次引入用以探索长距离染色质相互作用。该方法基于染色质的空间临近连接来分析一对特定基因组位点(一对一)的互作强度。在3C技术的基础上，包括4C(一个位点对所有位点)和5C(多对多)技术被开发用于研究基因组的结构和染色质交互。随着高通量测序技术的发展，后来衍生的Hi-C技术可以用来探索染色质所有位点对所有位点的交互，产生全基因组的染色质交互图谱。利用Hi-C技术，科学家们发现哺乳动物的基因组可以被分为活跃的A区室和不活跃的B区室。进一步区室可以被分隔为小的结构域，这些结构域被称为拓扑结构域(TADs)并且被视为基因组的基本单位。在更高的分辨率下，可以发现染色质交互图谱上，某些位点间的互作信号明显强于其周围位点间的互作信号，这些更强的位点间的互作被称为loops。在Hi-C的基础上，一些衍生的技术在一定程度上提高了实验的可操作性，数据的有效性，并降低了成本，包括TCC，insituHi-C，DNaseHi-C，CaptureHi-C等。尽管如此，新的改善的技术在进一步提高信噪比，简化实验流程和降低成本方面仍是研究者们追求的目标。>最近报道的基于连接子(linker)连接的insituDLOHi-C在以上三个方面具有更优的表现，是目前最有效的研究全基因组三维构造的方法。但由于该方法得到的基因组不同互作位点的片段长度只有20bp，基因组比对率低，严重的限制了其在具有复杂或高重复序列基因组的物种中应用，特别是植物基因组，例如重复序列达到80％以上的玉米和高粱基因组。目前植物上三维基因组的研究相对于动物比较滞后，主要采用的研究方法是insituHi-C。利用此方法，科学家们在基因组较小的物种拟南芥和水稻上做了较多的工作，但由于其测序成本和分辨率的限制，使其很难较好的在大基因组的植物物种中进行分辨率较高的TADs和loops研究。对于世界第一大粮食作物玉米，目前也只有2-3篇文章报道，其基因组的三维构造仍需要更深层次的研究。因此，适合于植物的且更加有效的研究方法显得尤为重要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种简便有效的植物长片段insituDLOHi-C测序文库的构建方法，采用本专利技术提供的构建方法在以玉米为测试对象时，相对于已发表的insituHi-C方法在实验可操作性，产生的高通量数据信噪比和染色质交互(loops)鉴定上具有较强的优势。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种简便有效的植物长片段insituDLOHi-C测序文库的构建方法，包括以下步骤：1)将植物组织浸入含质量体积百分浓度1％甲醛的PBS交联缓冲液中交联10～20min，加甘氨酸终止交联、润洗，得到交联植物组织；2)将所述步骤1)得到的交联植物组织浸入PP缓冲液中，经刀片将交联植物组织至浆状，过滤，得到滤液，所述滤液中细胞核的数量为50～250万个；3)将所述步骤2)得到的滤液与十二烷基硫酸钠混合，得到第一混合物，将所述第一混合物在60～70℃下水浴4～6min后，与TritonX-100混合，得到第二混合物，将所述第二混合物在35～42℃下水浴8～12min，得到第一水浴物；4)将所述步骤3)得到的第一水浴物离心，得到细胞核，将所述细胞核与含限制性内切酶MseI的体系混合，在37℃下酶切6～12h，得到酶切物；所述含限制性内切酶MseI的体系组分为310μlddH2O、20μl体积百分浓度为20％的TritonX-100溶液、40μl10×NEBuffer2和酶活为10units/μl的30μl限制性内切酶MseI；5)将所述步骤4)得到的酶切物与带生物素标记的linker连接体系混合后，在20～25℃下连接50～70min，得到linker连接物；所述linker的制备方法包括：将前义链和后义链杂交后，得到linker，所述前义链的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述后义链的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；6)将所述步骤5)得到的linker连接物离心、润洗，得到细胞核，将所述细胞核与linker末端磷酸化体系混合后，在37℃下水浴25～35min，得到第二水浴物；所述linker末端磷酸化体系组分为170μlddH2O、20μl10×T4ligasebuffer、10μl酶活为10unit/μl的T4多聚核苷酸激酶和5μl体积百分浓度为20％的TritonX-100溶液；7)将所述步骤6)第二水浴物与连接体系混合后，在20～25℃下，使细胞核内的染色质临近连接1.5～3h，得到临近连接物；所述连接体系为：230μlddH2O、30μl10×T4ligasebuffer、40μl酶活为5units/μl的T4DNAligase和TritonX-100，所述连接体系中TritonX-100体积百分浓度为0.5％；8)将所述步骤7)得到的临近连接物离心，得到细胞核，将所述细胞核与解交联体系混合，在60～70℃下解交联2～6h后，纯化DNA，得到DNA；所述解交联体系为：440μlddH2O、10μl20mg/ml蛋白酶K、25μl质量体积百分浓度为20％的十二烷基硫酸钠溶液和25μl5MNaCl溶液；9)对链霉亲和素磁珠进行封闭，用2×bindingbuffer润洗磁珠2遍后，用I-blockbuffer重悬磁珠，室温旋转孵育45min～1.5h，磁珠再用1×bindingbuffer润洗2次，重悬在包含鱼精DNA的1×bindingbuffer中，25～30℃孵育30min～60min，磁珠再用1×bindingbuffer润洗2次，重悬于1×bindingbuffer中，得到预处理的链霉亲和素磁珠。10)将所述步骤8)得到的DNA与所述步骤9)得到的预处理的链霉亲和素磁珠混合，在20～30℃下孵育1～2h，收集磁珠；11)将所述步骤10)得到的磁珠用1×bindingbuffer润洗2遍后，与Tn5转座酶体系混合，在55℃下进行酶切15～25min后，收集磁珠；12)将所述步骤11)得到的磁珠用washbuffer在1000rpm、55℃、5min条件下清洗4～7次，同样条件下用1xbindingbuffer和Elutionbuffer各清洗一次，得到去除背景后的磁珠；13)用PCR体系重悬所述步骤12)得到的磁珠后，进行PCR扩增，得到扩增产物，将所述扩增产物经DNAcleanbeads筛选后，溶于ddH2O中，得到DNA长度300～600个碱基对的植物长片段insituD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简便有效的植物长片段in situ DLO Hi-C测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)将植物组织浸入含质量体积百分浓度1％甲醛的PBS交联缓冲液中交联10～20min，加甘氨酸终止交联、润洗，得到交联植物组织；/n2)将所述步骤1)得到的交联植物组织浸入PP缓冲液中，经刀片将交联植物组织至浆状，过滤，得到滤液，所述滤液中细胞核的数量为50～250万个；/n3)将所述步骤2)得到的滤液与十二烷基硫酸钠混合，得到第一混合物，将所述第一混合物在60～70℃下水浴4～6min后，与Triton X-100混合，得到第二混合物，将所述第二混合物在35～42℃下水浴8～12min，得到第一水浴物；/n4)将所述步骤3)得到的第一水浴物离心，得到细胞核，将所述细胞核与含限制性内切酶MseI的体系混合，在37℃下酶切6～12h，得到酶切物；/n所述含限制性内切酶MseI的体系组分为310μl ddH

【技术特征摘要】
1.一种简便有效的植物长片段insituDLOHi-C测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将植物组织浸入含质量体积百分浓度1％甲醛的PBS交联缓冲液中交联10～20min，加甘氨酸终止交联、润洗，得到交联植物组织；
2)将所述步骤1)得到的交联植物组织浸入PP缓冲液中，经刀片将交联植物组织至浆状，过滤，得到滤液，所述滤液中细胞核的数量为50～250万个；
3)将所述步骤2)得到的滤液与十二烷基硫酸钠混合，得到第一混合物，将所述第一混合物在60～70℃下水浴4～6min后，与TritonX-100混合，得到第二混合物，将所述第二混合物在35～42℃下水浴8～12min，得到第一水浴物；
4)将所述步骤3)得到的第一水浴物离心，得到细胞核，将所述细胞核与含限制性内切酶MseI的体系混合，在37℃下酶切6～12h，得到酶切物；
所述含限制性内切酶MseI的体系组分为310μlddH2O、20μl体积百分浓度为20％的TritonX-100溶液、40μl10×NEBuffer2和酶活为10units/μl的30μl限制性内切酶MseI；
5)将所述步骤4)得到的酶切物与带生物素标记的linker连接体系混合后，在20～25℃下连接50～70min，得到linker连接物；
所述linker的制备方法包括：将前义链和后义链杂交后，得到linker，所述前义链的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述后义链的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；
6)将所述步骤5)得到的linker连接物离心、润洗，得到细胞核，将所述细胞核与linker末端磷酸化体系混合后，在37℃下水浴25～35min，得到第二水浴物；
所述linker末端磷酸化体系组分为170μlddH2O、20μl10×T4ligasebuffer、10μl酶活为10unit/μl的T4多聚核苷酸激酶和5μl体积百分浓度为20％的TritonX-100溶液；
7)将所述步骤6)第二水浴物与连接体系混合后，在20～25℃下，使细胞核内的染色质临近连接1.5～3h，得到临近连接物；
所述连接体系为：230μlddH2O、30μl10×T4ligasebuffer、40μl酶活为5units/μl的T4DNAligase和TritonX-100，所述连接体系中TritonX-100体积百分浓度为0.5％；
8)将所述步骤7)得到的临近连接物离心，得到细胞核，将所述细胞核与解交联体系混合，在60～70℃下解交联2～6h后，纯化DNA，得到DNA；
所述解交联体系为：440μlddH2O、10μl20mg/ml蛋白酶K、25μl质量体积百分浓度为20％的十二烷基硫酸钠溶液和25μl5MNaCl溶液；
9)对链霉亲和素磁珠进行封闭，用2×bindingbuffer润洗磁珠2遍后，用I-blockbuffer重悬磁珠，室温旋转孵育45min～1.5h，磁珠再用1×bindingbuffer润洗2次，重悬在包含鱼精DNA的1×bindingbuffer中，25～30℃孵育30min～60min，磁珠再用1×bindingbuffer润洗2次，重悬于1×bindingbuffer中...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨芳，孙永浩，林达，曹罡，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42