一种利用ddPCR技术联合检测诊断乳腺癌的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用ddPCR技术联合检测诊断乳腺癌的方法，具体包括以下步骤：S1、提取样本中基因组DNA及miRNA，S2、DNA亚硫酸盐修饰和纯化定量，将miRNA逆转录成cDNA，S3、以纯化后的DNA基因组为模板、特异性引物为引物分别进行ddPCR，用来检测MASPIN甲基化状态，S4、计算待测样本maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W，并与样本中miR‑142含量联合分析，本发明专利技术涉及生物和疾病诊断技术领域。该利用ddPCR技术联合检测诊断乳腺癌的方法，可实现通过将maspin基因甲基化状态及miR‑142含量这两种指标联合检测用来评定是否患者换上乳腺癌的依据，数据更精确，结果更可靠，可广泛应用于乳腺癌早期筛查，有效辅助判断乳腺癌恶性程度和是否转移。

A method of combined detection and diagnosis of breast cancer by DDPCR

【技术实现步骤摘要】
一种利用ddPCR技术联合检测诊断乳腺癌的方法
本专利技术涉及生物和疾病诊断
，具体为一种利用ddPCR技术联合甲基化特异性PCR检测基因maspin甲基化状态和miR-142相对含量诊断乳腺癌的方法。
技术介绍
目前，乳腺癌筛查最常用的影像学方法是钼靶X线和超声。乳腺钼靶，全称乳腺钼靶X线摄影检查，又称钼钯检查，是目前诊断乳腺疾病的首选和最简便、最可靠的无创性检测手段，痛苦相对较小，简便易行，且分辨率高，重复性好，留取的图像可供前后对比，不受年龄、体形的限制，目前已作为常规的检查。它的特点是可以检测出医生触摸不到的乳腺肿块，特别是对于大乳房和脂肪型乳房，其诊断性可高达95％，对于以少许微小钙化为唯一表现的T0期乳腺癌(临床门诊阴性)，也只有凭借软X线检查才能被早期发现和诊断，对乳腺癌的诊断敏感性为82％～89％，特异性为87％～94％。但乳腺钼靶对肿瘤风险较高的致密性乳腺敏感度不高。超声检查简便易行，对浸润性乳腺癌较钼靶X线检查敏感。随着超声弹性成像、超声造影、超声三维成像等超声影像学新技术的迅猛发展及应用，超声波检查在乳腺癌的早期诊断中发挥越来越重要的作用，随着对乳腺癌研究的深入，钼靶X线和超声检查等现有检测诊断技术仍有以下明显短板：(1)不能检测早期原位乳腺癌的发生，即当乳腺癌发生早期没有形成明显肿瘤或者肿瘤块较小时，很难检测到。(2)很难预测乳腺癌是否会转移。(3)很难检测乳腺癌的早期转移。总之，现有检测技术已不能满足临床医师对肿瘤患者进行术前病理组织学分级、预估肿瘤分子分型的要求。失去对增殖的控制和对细胞凋亡/坏死的抗性被认为是包括乳腺癌在内的许多癌症类型的标志。在原发性肿瘤形成之后，可能发生转移，由此细胞获得迁移能力，侵入周围组织，进入血液和淋巴系统，然后渗出并定植于二级位点。转移部位的复发是乳腺癌患者死亡的主要原因。Maspin是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，是蛋白酶抑制剂serpin家族的成员，可作为肿瘤抑制基因，maspin已被证明可抑制细胞运动、侵袭和转移。maspin基因表达的丧失是乳腺癌中的常见事件，其导致侵袭潜力增加和转移性疾病的传播。乳腺癌细胞中maspin基因表达的丧失不是由于maspin基因的丢失或重新排列，而是由于调节maspin表达的因子在癌症进展期间被破坏。肿瘤抑制基因启动子中CpG二核苷酸的异常胞嘧啶甲基化通常与其致癌作用和癌症进展过程中染色质结构的变化及其转录沉默有关。研究表明，DNA高甲基化导致人乳腺癌中maspin基因的沉默。miR-142是miRNA家族成员之一在多种恶性肿瘤中表达异常，推测其在恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用。有研究显示乳腺癌组织中miR-142表达低于癌旁组织，并且乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468中miR-142表达均低于正常乳腺上皮细胞HBL-100。这说明miR-142异常表达与乳腺癌的发生有关，可能在乳腺癌的发生中起着抑癌基因的作用。本技术应用一种ddPCR技术联合甲基化特异性PCR检测基因maspin甲基化状态和miR-142相对含量诊断乳腺癌的方法作为检测乳腺癌的依据，相对于传统诊断方法数据更精确，结果更可靠，相对于已经公开的诊断方法，其结果更可信。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种利用ddPCR技术联合检测诊断乳腺癌的方法，相对于传统诊断方法数据更精确，结果更可靠，相对于已经公开的诊断方法，其结果更可信。(二)技术方案为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种利用ddPCR技术联合检测诊断乳腺癌的方法，具体包括以下步骤：S1、提取样本中基因组DNA及miRNA：采用商品化基因组提取试剂盒提取样品中总DNA，然后用商品化miRNA提取试剂盒提取样品中总miRNA，并测定DNA和miRNA的浓度，之后置于-80℃保存备用；S2、DNA亚硫酸盐修饰和纯化定量，将miRNA逆转录成cDNA：首先将2μg基因组DNA溶于50μL的三蒸水中，加入5.5μL的NaOH，在37℃变性20min，然后分别加入新配制的30μL的氢醌和520μL亚硫酸氢钠，在50℃水浴16h，之后用商品化DNA纯化试剂盒对DNA过柱纯化，过柱后DNA溶于50μL的灭菌去离子水，然后加入5μL的NaOH脱硫，1μL的糖原，再通过乙醇沉淀，重新溶解于20μL的TE溶液中，之后置于-20℃保存备用；S3、以纯化后的DNA基因组为模板、特异性引物为引物分别进行ddPCR，用来检测MASPIN甲基化状态，以miRNA逆转录后的cDNA为模板，以miR-142特异性引物为引物进行ddPCR，用来检测样本中miR-142含量：PCR反应进行总体积为20μL，含有8μL稀释的样品模板，10μL的2×ddPCRSupermix(无dUTP)，1μL的20×目标引物混合物(FAM)，1μL的20×参照引物混合物，PCR扩增后，将样品置于液滴读数器中，其使用双色检测系统分别分析每个液滴，使用QuantaSoft从液滴读取器提取原始荧光振幅数据，QuantaSoft软件对PCR阳性和PCR阴性液滴进行计数，并通过泊松统计确定原始样品中的目标DNA浓度，在ddPCR中，靶分子随机分布成液滴，在任何单个液滴中，存在零个，一个或多于一个的靶分子，根据Poisson的小数定律，如果存在可量化的独立事件的随机分布，则可以预测这些事件发生的可能性，因此，可以应用泊松分布来确定液滴中目标分子的数量，在给定荧光数据的情况下，每个液滴中存在0，1，2，3或更多目标分子的可能性，QuantaSoft将自动设置一个阈值线，高于该阈值线，液滴得分为正，使用阴性对照手动调节或设定阈值，对于本专利技术中分析的所有样品，使用非模板对照手动设置阈值线，对于基于泊松的精确计数，优化正液滴数与液滴总数之比非常重要，如果有太多的正滴和没有足够的空液滴，则不能应用泊松统计，结果将无效，这同样适用于具有少于10000个液滴或质量分数低于0.85的井。S4、计算待测样本maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W，并与样本中miR-142含量联合分析。优选的，所述步骤S2中变性所加入NaOH的浓度为2mol/L，且氢醌的浓度为10mmol/L。优选的，所述步骤S2中亚硫酸氢钠的浓度为3mol/L，且亚硫酸氢钠的pH为5.0。优选的，所述步骤S2中脱硫所加入NaOH的浓度为3mol/L，且加入糖原的浓度为20mg/ml。优选的，所述步骤S2中以10μL的RT反应体系进行实验：RNA1μg、5MmiRNART引物1μL、5X反转录buffer2μL、RtaseMix2μL以及Rnase-freeH2O补足10μL，将该体系混匀后，瞬时离心，并于-20℃保存备用。优选的，所述RT反应程序为：42℃60min，70℃10min。优选的，所述步骤S3中热循环条件包括在95℃下10分钟的活化期，接着是40个循环的两步热曲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用ddPCR技术联合检测诊断乳腺癌的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：/nS1、提取样本中基因组DNA及miRNA：采用商品化基因组提取试剂盒提取样品中总DNA，然后用商品化miRNA提取试剂盒提取样品中总miRNA，并测定DNA和miRNA的浓度，之后置于-80℃保存备用；/nS2、DNA亚硫酸盐修饰和纯化定量，将miRNA逆转录成cDNA：首先将2μg基因组DNA溶于50μL的三蒸水中，加入5.5μL的NaOH，在37℃变性20min，然后分别加入新配制的30μL的氢醌和520μL亚硫酸氢钠，在50℃水浴16h，之后用商品化DNA纯化试剂盒对DNA过柱纯化，过柱后DNA溶于50μL的灭菌去离子水，然后加入5μL的NaOH脱硫，1μL的糖原，再通过乙醇沉淀，重新溶解于20μL的TE溶液中，之后置于-20℃保存备用；/nS3、以纯化后的DNA基因组为模板、特异性引物为引物分别进行ddPCR，用来检测MASPIN甲基化状态，以miRNA逆转录后的cDNA为模板，以miR-142特异性引物为引物进行ddPCR，用来检测样本中miR-142含量：PCR反应进行总体积为20μL，含有8μL稀释的样品模板，10μL的2×ddPCR Supermix，1μL的20×目标引物混合物(FAM)，1μL的20×参照引物混合物，PCR扩增后，将样品置于液滴读数器中，其使用双色检测系统分别分析每个液滴，使用QuantaSoft从液滴读取器提取原始荧光振幅数据，QuantaSoft软件对PCR阳性和PCR阴性液滴进行计数，并通过泊松统计确定原始样品中的目标DNA浓度，在ddPCR中，靶分子随机分布成液滴，在任何单个液滴中，存在零个，一个或多于一个的靶分子，根据Poisson的小数定律，如果存在可量化的独立事件的随机分布，则预测这些事件发生的可能性，因此，应用泊松分布来确定液滴中目标分子的数量，在给定荧光数据的情况下，每个液滴中存在0，1，2，3或多目标分子的可能性，QuantaSoft将自动设置一个阈值线，高于该阈值线，液滴得分为正，使用阴性对照手动调节或设定阈值，如果有多的正滴和没有足够的空液滴，则不能应用泊松统计，结果将无效。/nS4、计算待测样本maspin编码序列上游调控区域CpG岛的甲基化程度W，并与样本中miR-142含量联合分析。/n...

【技术特征摘要】
1.一种利用ddPCR技术联合检测诊断乳腺癌的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、提取样本中基因组DNA及miRNA：采用商品化基因组提取试剂盒提取样品中总DNA，然后用商品化miRNA提取试剂盒提取样品中总miRNA，并测定DNA和miRNA的浓度，之后置于-80℃保存备用；
S2、DNA亚硫酸盐修饰和纯化定量，将miRNA逆转录成cDNA：首先将2μg基因组DNA溶于50μL的三蒸水中，加入5.5μL的NaOH，在37℃变性20min，然后分别加入新配制的30μL的氢醌和520μL亚硫酸氢钠，在50℃水浴16h，之后用商品化DNA纯化试剂盒对DNA过柱纯化，过柱后DNA溶于50μL的灭菌去离子水，然后加入5μL的NaOH脱硫，1μL的糖原，再通过乙醇沉淀，重新溶解于20μL的TE溶液中，之后置于-20℃保存备用；
S3、以纯化后的DNA基因组为模板、特异性引物为引物分别进行ddPCR，用来检测MASPIN甲基化状态，以miRNA逆转录后的cDNA为模板，以miR-142特异性引物为引物进行ddPCR，用来检测样本中miR-142含量：PCR反应进行总体积为20μL，含有8μL稀释的样品模板，10μL的2×ddPCRSupermix，1μL的20×目标引物混合物(FAM)，1μL的20×参照引物混合物，PCR扩增后，将样品置于液滴读数器中，其使用双色检测系统分别分析每个液滴，使用QuantaSoft从液滴读取器提取原始荧光振幅数据，QuantaSoft软件对PCR阳性和PCR阴性液滴进行计数，并通过泊松统计确定原始样品中的目标DNA浓度，在ddPCR中，靶分子随机分布成液滴，在任何单个液滴中，存在零个，一个或多于一个的靶分子，根据Poisson的小数定律，如果存在可量化的独立事件的随机分布，则预测这些事件发生的可能性，因此，应用泊松分布来确定液滴中目标分子的数量，在给定荧光数据的情况下，每个液滴中存在0，1，2，3或多目标分子的可能性，QuantaSoft将自动设置一个阈值线，高于该阈值线，液滴得分为正，使用阴性对照手动调节或设定阈值，如果有多的正滴和没有足够...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖兴华，李含含，刘美君，李佳蓬，王君，张慧敏，李会，黄优，沈超，张同存，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42