一种产物专一性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体R81T制造技术

本发明专利技术提供了一种产物专一性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体R81T，属于酶工程领域，所述CGTase突变体R81T的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术还提供了包含所述SEQ ID NO.3的核苷酸序重组表达载体pET‑r81t，以及包含该重组表达载体pET‑r81t的重组菌。

A cyclodextrin glucosyltransferase mutant r81t with improved product specificity

【技术实现步骤摘要】
一种产物专一性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体R81T
本专利技术涉一种产物专一性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体R81T，属于酶工程领域。
技术介绍
环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextringlycosyltransferase,CGTase)能够催化包括环化，水解，偶联和歧化在内的四种反应，其中环化反应是特征性反应，该反应可以以淀粉类基质作底物合成环糊精(Cyclodextrin,CD)。目前，酶法合成是工业生产环糊精的主要方法。常见的环糊精包括α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)和γ-环糊精(γ-CD)，分别为通过α-1,4糖苷键连接的6、7和8个葡萄糖单元组成的。环糊精分子具有外部亲水性和内部疏水性，其疏水性空腔可以包裹疏水性分子或基团形成包合物，改变被包埋物的物理及化学性质，因此在食品、药品和化妆品等方面有着广泛的应用。CGTase生产环糊精最不利的条件之一是产物特异性差，所有已知的CGTase生产的环糊精产物均是α-、β-和γ-CD的混合物，不利于产物的分离纯化。
技术实现思路
本专利技术的要解决的技术问题在于提供一种产物专一性提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体R81T，该突变体提高了β-CD产物的专一性，为以后产物的分离纯化带来便利。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：本专利技术提供了一种编码CGTase突变体R81T的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。一种上述核苷酸序列编码的CGTase突变体R81T，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。一种重组表达载体pET-r81t,它包含了SEQIDNO.3所示核苷酸序列，表达载体为pET-24a。一种重组菌，它包含了重组表达载体pET-r81t，所述的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。CGTase突变体R81T与野生型相比，进行了一个位点的定点突变，将SEQIDNO.2所示的CGTaseN末端起第81位氨基酸的精氨酸(R)置换为苏氨酸(T)，其催化得到的环糊精产物中，α-CD产量降低，相对提高了β-CD产物的专一性。制备环糊精葡萄糖基转移酶突变体R81T的方法包括以下步骤：(1)利用PCR技术,以含野生酶基因(序列如SEQIDNO.1)的表达载体pET24a-cgt为模板进行定点突变,所用引物分别是：正向引物:5’-CTTAACAAAATATTGTGGTGGAGATTGGCAAGG-3’，反向引物:5’-TTTTTACAATCCTCCGAATAAAGTTCTCCTGATGGG-3’。用Q5定点突变试剂盒(NEB)进行定点突变，得到突变表达载体pET-r81t，将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用卡那霉素抗性筛选及测序确定含CGTase突变体的重组菌株；(2)将步骤(1)得到的突变菌株与未突变的原始重组菌株接种于含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37℃、200r/min培养过夜培养获得种子液；将种子液以体积比1％-2％的量接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，待OD600达为0.6-0.8时，加入终浓度0.4mM的IPTG诱导，诱导温度为20℃，诱导时间为15小时；(3)将步骤(2)得到的发酵液将于4℃，8000rpm离心20min收集菌体，超声破碎后使用亲和层析柱对CGTase及其突变体进行纯化，获得电泳纯的CGTase及其突变体。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术通过对野生酶基因进行定点突变，获得本专利技术CGTase突变体R81T，所述突变体酶能够降低α-CD产量，提高β-CD所占产物比例，且突变体酶学性质方面无明显变化，保留了原始酶良好的耐热性、耐碱性及热稳定性。附图说明图1、环糊精葡萄糖基转移酶及其突变体纯化电泳图；泳道1，纯化后的原始酶；泳道2，纯化后的突变酶；泳道M，蛋白Marker；图2、原始酶及突变酶在40℃下作用于1％(w/v)的可溶性淀粉生成环糊精情况；A,突变体R81T；B，原始酶；图3、(A)原始酶及突变酶的最适温度曲线；(B)原始酶和突变酶热稳定性曲线；(C)原始酶和突变酶最适pH曲线；(D)原始酶和突变酶pH稳定性曲线。具体实施方式下面通过实施例来对本专利技术的技术方案作进一步解释，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。实施例1突变位点的确定通过对同源建模得到的CGTase三维结构可以看出，R81位于底物结合的活性凹槽周围，与结合底物有氢键作用力，该位点的突变可能对产物的特异性有较大的影响。同时通过α-β-及γ-CGTase的氨基酸序列进行比对可以发现第81位氨基酸位点在α-CGTase为赖氨酸，在β-CGTase中为精氨酸，在γ-CGTase中为苏氨酸，精氨酸和赖氨酸虽然种类不同，但性质与结构相似，都属于碱性氨基酸。而苏氨酸属于酸性氨基酸，且侧链较小。所以推测通过定点突变的方法将原始酶第81位的精氨酸突变为苏氨酸可能对产物特异性有一定影响。实施例2突变体R81T的制备(1)定点突变利用PCR技术,以含野生酶基因(序列如SEQIDNO.1)的表达载体pET24a为模板进行定点突变,所用引物分别是：正向引物:5’-CTTAACAAAATATTGTGGTGGAGATTGGCAAGG-3’，反向引物:5’-TTTTTACAATCCTCCGAATAAAGTTCTCCTGATGGG-3’。用Q5定点突变试剂盒(NEB)进行定点突变，PCR反应体系为Q5HotStartHigh-Fidelity2XMasterMix12.5μL、ForwardPrimer(10μM)1.25μL、ReversePrimer(10μM)1.25μL、模板DNA(10ng)1μl、Nuclease-freewater9μl；PCR反应条件为98℃30s；98℃10s，68℃30s，72℃4min，25个循环；72℃2min；然后对扩增产物进行环化和模板去除反应，将扩增产物直接加入到Kinase-Ligase-DpnI(KLD)酶混合液中，室温条件下放置5min后转化E.coliDH5α，37℃放置过夜，挑取平板单菌落测序。测序正确的突变体提质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用卡那霉素抗性筛选出含突变CGTase的重组菌株；(2)突变体的表达与纯化将保菌的甘油菌按1％的接种量接种到5mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB试管，37℃，200r/min过夜培养作为种子液。再将种子液以体积比1％-2％的接种量接种到150mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，待OD600达为0.6-0.8时，加入终浓度0.4mM的IPTG诱导，诱导温度为20℃，诱导时间为18小时。诱导结束后8000r/min离心20min收集菌体，用10mL的pH8.0的磷酸盐缓冲液重悬菌体，冰浴中超声破碎，然后8000r/min离心60min后取上清制成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CGTase突变体R81T，其特征在于所述CGTase突变体R81T的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种CGTase突变体R81T，其特征在于所述CGTase突变体R81T的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


2.根据权利要求1所述的一种CGTase突变体R81T，其特征在于所述核苷酸序列SEQIDNO.3编码的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝建华，王伟，孙晶晶，李晓涵，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37