壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法和应用，涉及细胞工程技术领域。本发明专利技术的制备方法包括以下步骤：预处理：清洗壁蜕膜组，离心，去除上清液；消化：将壁蜕膜组织剪碎，加入组织消化液进行消化，消化完成分离上清液和沉淀，将沉淀重悬得悬液；所述组织消化液中包括Tryple酶、生理盐水、I型胶原酶和Ⅱ型胶原酶，所述Tryple酶的体积浓度为40～60％，I型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL，Ⅱ型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL；分离：向悬液中加入淋巴细胞分离液，离心，分层后分离出单个核细胞，离心，保留沉淀，加入培养液，混匀，即得壁蜕膜亚全能干细胞分离液。本发明专利技术可以成功从壁蜕膜组织中提取亚全能干细胞，细胞活性好、分化能力强。

【技术实现步骤摘要】
壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法和应用
本专利技术涉及细胞工程
，特别是涉及壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法和应用。
技术介绍
干细胞是一类具有自我复制、更新和多向分化潜能的细胞，可以分化为各种组织器官，干细胞已经成为生命科学领域的研究热点。科学家发现多种成体组织中都存在一类原始干细胞群体，它们和造血干细胞、神经干细胞等多能干细胞不同，多能干细胞只能分化为特定胚层的细胞，而这类原始干细胞可分化为不同胚层的组织细胞。这类原始干细胞还区别于胚胎干细胞，在个体生长发育过程中逐渐失去部分分化潜能，并且会出现一些特殊表型或者分子标志，被称为成体亚全能干细胞。亚全能干细胞具有下列特性：可分化为不同胚层的细胞，胚胎期的亚全能干细胞可分化为不同类型的多能干细胞，并在生长发育和新陈代谢中维持平衡；参与机体自我修复和更新，不仅能分化为所在器官的组织特异性细胞，参与器官重塑，还可以在炎症因子或者生长因子的趋化作用下，远处转移修复受损组织。因此，成体亚全能干细胞在参与组织损伤修复和弥补干细胞数量不足上都发挥着重要的作用，能够分离纯化、培养和可有效利用的成体亚全能干细胞具有重要意义。目前，亚全能干细胞的提取存在一些阻碍，一方面现有的亚全能干细胞大多数是从人胎盘中提取得到，存在一定的伦理问题，另一方面现有的提取方法得到的亚全能干细胞活性低、分化能力有限，限制了亚全能干细胞在临床治疗中的应用。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，该方法提取的壁蜕膜亚全能干细胞的数量多、活性好、分化能力强，为临床治疗提供基础。一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，包括以下步骤：预处理：清洗壁蜕膜组织，离心，去除上清液；消化：将壁蜕膜组织剪碎，加入组织消化液进行消化，消化完成分离上清液和沉淀，将沉淀重悬得悬液；所述组织消化液中包括Tryple酶、生理盐水、I型胶原酶和Ⅱ型胶原酶，所述Tryple酶的体积浓度为40～60％，I型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL，Ⅱ型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL；分离：向悬液中加入淋巴细胞分离液，离心，分层后分离出单个核细胞，离心，保留沉淀，加入培养液，混匀，即得壁蜕膜亚全能干细胞分离液。上述制备方法，使用组织消化液成功从壁蜕膜组织中提取到亚全能干细胞，提取得到的细胞数量多、纯度高、活性好、分化能力强，可应用于临床；本专利技术的方法提供了一种新的亚全能干细胞提取来源——壁蜕膜组织，壁蜕膜组织来源丰富，不存在伦理争议，具有广阔的应用前景。在其中一个实施例中，所述预处理步骤中，离心转速为1000～1500r/min，离心时间为4～6min；所述清洗液包括：生理盐水、体积分数为45～55％的红细胞裂解液、8～12μg/ml的硫酸庆大霉素、8～12μg/ml的两性霉素B。细胞裂解液可以裂解将红细胞，清除血液，减少污染。在其中一个实施例中，所述消化步骤具体为：将壁蜕膜组织剪碎成0.1～1cm3的碎块，加入0.8～1.5倍体积的组织消化液，混合均匀，在恒温震荡仪中震荡消化1～4h，温度控制为37±0.5℃，震荡转速为180～220r/min，消化完成分离上清液和沉淀，向沉淀中加入生理盐水重悬。在其中一个实施例中，所述分离步骤具体为：向悬液中加入1.2～1.8倍体积的淋巴细胞分离液，离心8～12min，离心转速为1000-2000r/min，分层后，分离出位于第三层的单个核细胞，继续离心8～12min，离心转速为1000-2000r/min，保留沉淀，加入0.3～0.8倍体积的DMEM/F12培养液，混匀，即得壁蜕膜亚全能干细胞分离液。在其中一个实施例中，所述分离步骤后还包括培养步骤：将壁蜕膜亚全能干细胞分离液以2～4×105个/mL的密度进行接种，在温度为37±0.5℃，CO2浓度为5±0.5％的培养箱中静置培养，标记为P0代，每隔3～4天更换40～60％含双抗的完全培养液。在其中一个实施例中，所述培养步骤后还包括储存步骤：待P3代亚全能干细胞融合度达到80～90％时，完全弃掉培养液，清洗，加入消化液消化，离心，加入亚全能干细胞冻存液，放置于液氮中冻存。在其中一个实施例中，所述储存步骤具体为：待P3代亚全能干细胞融合度达到80～90％时，完全弃掉培养液，用PBS清洗1～3次，加入消化液消化1～10min，加入完全培养液终止消化，500-1000r/min转速下离心5～7min，弃掉上清，向沉淀中加入亚全能干细胞冻存液，细胞浓度为1～6×106个/mL，放置于液氮中冻存。在其中一个实施例中，所述消化液包括质量百分数为0.2～0.3％的胰蛋白酶和质量百分数为0.003～0.005％的EDTA。在其中一个实施例中，所述亚全能干细胞冻存液包括质量百分数为28～32％的甘油、质量百分数为13～17％的维生素C和质量百分数为15～25％的SR无血清培养基。上述亚全能干细胞冻存液可以使亚全能干细胞在长时间的保存过程中依然能保持良好的活性和分化能力，细胞存活率高。本专利技术一方面还提供一种采用上述制备方法得到的壁蜕膜亚全能干细胞。该壁蜕膜亚全能干细胞纯度高、数量多、活性好、分化能力强，可应用于临床治疗。本专利技术一方面还提供一种采用上述制备方法得到的壁蜕膜亚全能干细胞在制备成骨细胞和子宫内膜上皮细胞中的应用。本专利技术一方面还提供一种上述壁蜕膜亚全能干细胞分化为成骨细胞的方法，包括以下步骤：将壁蜕膜亚全能干细胞按照1～3×104/mL的浓度接种，每3～4天更换一次成骨细胞分化诱导培养基，成骨细胞诱导培养基的成分为：DMEM为基底液，血清替代物8～12vt％，地塞米松8～12nM/mL，β-磷酸甘油8～12M/mL，抗生素0.5～1.5wt％，细胞因子IL-β20～30ng/mL，抗坏血酸100～110mM/mL，异黄酮8～12μg/mL。采用该成骨细胞分化诱导培养基可以有效诱导壁蜕膜亚全能干细胞分化为成骨细胞。本专利技术一方面还提供一种上述壁蜕膜亚全能干细胞分化为子宫内膜上皮细胞的方法，包括以下步骤：将壁蜕膜亚全能干细胞按照1～2×105/mL的浓度接种，每3～4天更换一次子宫内膜上皮细胞分化诱导培养基，子宫内膜上皮细胞诱导培养基的成分为：DMEM培养基为基底液，血清替代品3～7vt％，维生素C0.5～1.5wt％，地塞米松10～20nM/mL，非必需氨基酸0.5～1.5wt％，TGF-β115～25ng/mL，EGF15～25ng/mL，PDGF-BB15～25ng/mL，雌二醇25～35ng/mL。采用该子宫内膜上皮细胞分化诱导培养基可以有效诱导壁蜕膜亚全能干细胞分化为子宫内膜上皮细胞。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的制备方法，使用组织消化液成功从壁蜕膜组织中提取到亚全能干细胞，提取得到的细胞数量多、纯度高、活性好、分化能力强，可应用于临床；本专利技术的方法提供了一种新的亚全能干细胞提取来源——壁蜕膜组织，壁蜕膜组织来源丰富，不存在伦理争议，具有广阔的应用前景。...

【技术保护点】
1.一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n预处理：清洗壁蜕膜组织，离心，去除上清液；/n消化：将壁蜕膜组织剪碎，加入组织消化液进行消化，消化完成分离上清液和沉淀，将沉淀重悬得悬液；所述组织消化液中包括Tryple酶、生理盐水、I型胶原酶和Ⅱ型胶原酶，所述Tryple酶的体积浓度为40～60％，I型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL，Ⅱ型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL；/n分离：向悬液中加入淋巴细胞分离液，离心，分层后分离出单个核细胞，离心，保留沉淀，加入培养液，混匀，即得壁蜕膜亚全能干细胞分离液。/n

【技术特征摘要】
1.一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
预处理：清洗壁蜕膜组织，离心，去除上清液；
消化：将壁蜕膜组织剪碎，加入组织消化液进行消化，消化完成分离上清液和沉淀，将沉淀重悬得悬液；所述组织消化液中包括Tryple酶、生理盐水、I型胶原酶和Ⅱ型胶原酶，所述Tryple酶的体积浓度为40～60％，I型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL，Ⅱ型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL；
分离：向悬液中加入淋巴细胞分离液，离心，分层后分离出单个核细胞，离心，保留沉淀，加入培养液，混匀，即得壁蜕膜亚全能干细胞分离液。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预处理步骤中，离心转速为1000～1500r/min，离心时间为4～6min；所述清洗液包括：生理盐水、体积分数为45～55％的红细胞裂解液、8～12μg/mL硫酸庆大霉素、8～12μg/mL两性霉素B。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述消化步骤具体为：将壁蜕膜组织剪碎成0.1～1cm3的碎块，加入0.8～1.5倍体积的组织消化液，混合均匀，在恒温震荡仪中震荡消化1～4h，温度控制为37±0.5℃，震荡转速为180～220r/min，消化完成分离上清液和沉淀，向沉淀中加入生理盐水重悬。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分离步骤具体为：向悬液中加入1.2～1.8倍体积的淋巴细胞分离液，离心8～12min，离心转速为1000-2000r/min，分层后，分离出位于第三层的单个核细胞，离心8～12min，离心转速为1000-2000r/min，保留沉淀，加入0.3～0.8倍...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小翠，李静静，赵蓝，孙灿兴，江嘉豪，褚一凡，
申请(专利权)人：广东唯泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44