一种链霉菌及其筛选方法与应用技术

一种链霉菌及其筛选方法与应用，属于微生物学领域。为了提高番茄对植物病害的抵抗能力，本发明专利技术提供一种链霉菌(Streptomyces sp.)NEAU‑HV9，其菌种保藏编号为CGMCC 19436。本发明专利技术还提供该菌株在抑制引起植物病害的病原细菌活性以及生产放线菌素D中的应用，利用该链霉菌菌株NEAU‑HV9可制备菌剂，可用于抑制植物番茄青枯病，本发明专利技术为研究开发环境友好型的放线菌菌剂提供优质的材料。

【技术实现步骤摘要】
一种链霉菌及其筛选方法与应用
本专利技术属于微生物学领域，具体涉及一种链霉菌及其筛选方法与应用。
技术介绍
番茄是世界上最重要的蔬菜作物之一，全球年产量约为1.6亿吨。在我国，长期连作是番茄的主要栽培方式，已导致严重的青枯病，它是由茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种会导致全株萎蔫的土传细菌性疾病。番茄青枯病不但危害严重，发病地带也尤为广泛，是热带、亚热带、温带地区番茄生产的重要病害。由于这种病害地理分布范围广，寄主范围广，且具有毁灭性和长期性，目前尚无有效的化学防治方法，并且化学农药的大量使用带来了一系列的环境问题。生物防治因其成本低、环境友好和无药物残留等特点已成为当前国内外防治植物土传病害的研究热点，并将逐步取代传统的化学防治手段，具有广阔的应用前景。放线菌在自然界中分布极广，在含水量低、有机质丰富的土壤(pH中性或微碱性)中放线菌含量最多，并且从土壤中分离到的放线菌经鉴定多为链霉菌属。链霉菌作为生物控制剂，在农业上越来越受到重视。许多链霉菌已被用于控制土传疾病，例如Streptomycesaureofaciens，Streptomycesavermitilis，Streptomyceslividans，Streptomyceshumidus等。链霉菌的防病机制主要包括以下三方面：营养竞争及空间位点竞争；生防菌产生一种或多种物质在较低浓度下能抑制其他生物的生长或杀死；通过代谢产生抗生素、葡聚糖酶酶、几丁质酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶等胞外酶，使病原菌的芽管生长变慢、变细或菌体消解。链霉菌是生物活性化合物的重要来源，其产量占市面上可用抗生素的三分之二。且具有孢子抗逆性强、菌剂保藏时间长及诱导寄主植物产生系统抗性等优点。因此筛选具有抗病活性的链霉菌资源，开发可逐步替代化学农药的新型微生物产品对实现农产品产量与质量安全、农业生态环境保护相协调的可持续发展具有重要意义。
技术实现思路
为了提高番茄对植物病害的抵抗能力，本专利技术提供了一种链霉菌(Streptomycessp.)NEAU-HV9，菌种保藏编号为CGMCC19436。本专利技术还提供了上述链霉菌的筛选方法，步骤如下：采集土样，以每5g土样计，将5g晾干的土样溶解到45ml无菌水中，在180rpm转速下振荡30-45分钟，静置后，取上层液体稀释1000倍，吸取200μl的稀释液涂布于HV培养基上，置于28℃中培养，挑取单菌落接种到ISP3培养基，经反复转接得到纯化菌株，命名为NEAU-HV9。进一步地限定，所述土样采集于中国广西壮族自治区河池市巴马瑶族自治县。本专利技术还提供了上述链霉菌在抑制引起植物病害的病原细菌活性中的应用。进一步地限定，所述引起植物病害的病原细菌为番茄青枯病原菌(Pseudomonassolanacearum)。本专利技术还提供了一种抑制植物番茄青枯病的菌剂组合物，所述菌剂组合物含有上述的链霉菌(Streptomycessp.)NEAU-HV9和农业上可接受的辅剂。本专利技术还提供了上述链霉菌(Streptomycessp.)NEAU-HV9在生产放线菌素D中的应用。进一步地限定，所述放线菌素D的生产方法如下：将上述的链霉菌(Streptomycessp.)NEAU-HV9接种到ISP2液体培养基中，28℃，250rpm条件下培养得到种子液，然后将种子液接种于发酵培养基中，28℃，250rpm进行发酵培养，将所得发酵液离心，获得的上清液依次经萃取、层析后得到放线菌素D。本专利技术还提供了上述生产方法获得的放线菌素D在抑制引起植物病害的病原细菌活性中的应用。进一步地限定，所述引起植物病害的病原细菌为番茄青枯病原菌(Pseudomonassolanacearum)。有益效果本专利技术提供了一种具有植物抗病能力的链霉菌(Streptomycessp.)NEAU-HV9，其对番茄青枯病有显著拮抗作用，将该菌株的孢子水悬浮液作用番茄，可明显抑制番茄青枯病的发生。本专利技术提供的放线菌(Streptomycessp.)NEAU-HV9还可产生放线菌素D，放线菌素D的水溶液可以有效防治番茄青枯病的发生。本专利技术为研究开发环境友好型的放线菌菌剂提供优质的材料。附图说明图1为菌株NEAU-HV9在扫描电镜下的菌丝和孢子形态；图2为菌株NEAU-HV9的16SrDNA序列系统发育地位；图3为菌株NEAU-HV9对病原细菌的平皿拮抗效果；图4为菌株NEAU-HV9的孢子水悬浮液在番茄苗期对番茄青枯病的拮抗效果；图5为菌株NEAU-HV9的孢子水悬浮液对番茄青枯病的生物防治特性测定；图6为放线菌素D结构；图7为放线菌素D对番茄苗期番茄青枯病的拮抗效果；图8为放线菌素D对番茄青枯病的生物防治特性测定。具体实施方式以下通过具体实施实例对本专利技术作进一步说明，但不用以限制本专利技术，凡在本专利技术精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本专利技术提供的培养基、试剂等如无特殊说明均可由市场购得。实施例1.链霉菌Streptomycessp.NEAU-HV9的筛选和鉴定。1.菌株的分离和培养土样采集于中国广西壮族自治区河池市巴马瑶族自治县(24°15′N,107°26′E)，将5g晾干的土样溶解到45ml无菌水的三角瓶中(带玻璃珠)，在180rpm转速下振荡30-45分钟，静置10分钟后，取上层液体稀释1000倍后，吸取200μl的稀释液涂布于HV培养基(腐殖酸0.1g，MgSO4·7H2O0.05g，KCl0.17g，Na2HPO4·3H2O0.05g，FeSO40.001g，CaCO30.002g，复合维生素0.1ml，琼脂2g，无菌水100ml)平板培养基上，置于28℃中培养7天，挑取单菌落接种到新鲜ISP3平板培养基(燕麦2g，K2HPO4·3H2O0.05g，MgSO4·7H2O0.02g，KNO30.02g，琼脂2g，无菌水100ml)，经反复转接得到纯化菌株，将纯化的菌株命名为NEAU-HV9，用20％甘油保存于-80℃超低温冰箱中。2.菌株的鉴定鉴定方法：通过形态学特征，生理生化实验，细胞化学组分和16SrDNA序列分析对该菌株进行鉴定。菌体形态特征：革兰氏染色阳性，在ISP3培养基上培养2周，气生菌丝颜色为白色，基内菌丝为黄色，并产生大量的黄色色素；扫描电镜下观察Streptomycessp.NEAU-HV9气生菌丝呈螺旋状的孢子链，孢子表面粗糙，见图1。生长温度范围：10-37℃，最适宜生长温度28℃，生长pH范围：5-9；最适pH7.0，生长NaCl范围：0-7％。生理生化特征：好氧，产生淀粉酶、酯酶、脲酶和过氧化氢酶，其淀粉水解、黄嘌呤分解、酪氨酸分解、酪蛋白分解、吐温水解、脲酶、纤维素分解，H2S产生、过氧化氢分解和七叶苷水解实验阳性，明胶水解、腺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种链霉菌(Streptomyces sp.)NEAU-HV9，菌种保藏编号为CGMCC 19436。/n

【技术特征摘要】
1.一种链霉菌(Streptomycessp.)NEAU-HV9，菌种保藏编号为CGMCC19436。


2.权利要求1所述的链霉菌的筛选方法，其特征在于，步骤如下：
采集土样，以每5g土样计，将5g晾干的土样溶解到45ml无菌水中，在180rpm转速下振荡30-45分钟，静置后，取上层液体稀释1000倍，吸取200μl的稀释液涂布于HV培养基上，置于28℃中培养，挑取单菌落接种到ISP3培养基，经反复转接得到纯化菌株，命名为NEAU-HV9。


3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述土样采集于中国广西壮族自治区河池市巴马瑶族自治县。


4.权利要求1所述的链霉菌在抑制引起植物病害的病原细菌活性中的应用。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引起植物病害的病原细菌为番茄青枯病原菌(Pseudomonassolanacearum)。


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【专利技术属性】
技术研发人员：赵军伟，向文胜，凌玲，王相晶，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23