重组人源Ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法。所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白含有498个氨基酸，理论分子量约54.5kd，构建的重组人源Ⅲ型胶原蛋白表达菌株能够有效稳定和大量地表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白。本发明专利技术的重组人源胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。

Recombinant human collagen type \u2162, expression strain and its construction method

【技术实现步骤摘要】
重组人源Ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种重组人源III型胶原蛋白、表达重组人源III型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌及其构建方法。
技术介绍
胶原(Collagen)是脊椎动物体内最重要的结构蛋白，约占蛋白总量的25～30％。作为细胞外基质中含量最丰富的蛋白，胶原是结缔组织和几乎所有薄壁器官间隙组织中最主要的结构蛋白，起着稳定组织和器官并维持其结构完整的作用。由于天然胶原蛋白不易溶于水，且使用的通常为牛或猪来源的胶原，分子量大小不等，性质非常复杂，难于进行进一步的加工，存在动物病毒隐患，限制了其作为生物材料在医疗器械等领域的应用。因此，研究通过基因构建技术，利用生物反应器表达重组胶原蛋白来解决这些问题，且已经取得良好进展。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是一种外源蛋白表达系统，既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统不具有的对外源蛋白的修饰如糖基化、蛋白磷酸化等特点。在过去的20年中已有200多种不同蛋白在毕赤酵母中实现了成功表达，其中许多产品已被广泛应用于临床的诊断治疗和科研工作中。在毕赤酵母表达系统中外源基因不是存在于自主复制的表达载体中，而是和表达载体一起通过同源重组整合在酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象；毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可实现细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋白，发酵产物的累积不会对其产生毒副作用，并且毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，便于纯化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种亲水性优异的重组人源III型胶原蛋白，以及分泌表达该蛋白的毕赤酵母工程菌及其构建方法，能高效、安全地进行重组人源III型胶原蛋白的胞外分泌表达。实现本专利技术目的的技术方案如下：本专利技术的重组人源III型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQNo.2所示。本专利技术的重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa，核苷酸序列如SEQNo.3所示。本专利技术构建的重组人源III型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的核苷酸序列如SEQNo.4所示，通过将重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa双酶切连接至ppic9K载体的EcoRI和NotI间构建而成。本专利技术构建的分泌表达重组人源III型胶原蛋白的菌株为巴斯德毕赤酵母PichiapastorisJY0301，保藏编号为CGMCCNo.16462，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的巴斯德毕赤酵母PichiapastorisJY0301通过将SacI酶切得到的线性化重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa诱导入巴斯德毕赤酵母中构建而成。本专利技术从已知序列的人体胶原蛋白基因III型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。本专利技术的重组人源III型胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，在生物医用材料、化妆品等领域具有潜在的应用前景。附图说明图1为人Ⅲ型α链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。图2为重组人源Ⅲ型胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。图3为重组人源Ⅲ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的构建示意图。图4为重组人源Ⅲ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的SacI酶切琼脂糖凝胶电泳图。图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。图6为阳性克隆菌株的凝胶电泳图。图7为阳性克隆菌株的PCR凝胶电泳图。图8为#3，#4，#5，#10阳性克隆菌株培养48和72小时的样品的蛋白表达分析图。图9为#10阳性克隆菌株的蛋白表达的SDS-PAGE电泳图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详述。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。1.蛋白序列选择对人Ⅲ型α链胶原蛋白的氨基酸序列(SEQNo.1)进行疏水性分析，评价结果如图1所示。疏水性评价分值越低其亲水性越好。选择评分低的氨基酸片段，将这些片段整合成新的蛋白，即本专利技术的重组人源Ⅲ型胶原蛋白(SEQNo.2)。对重组人源Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸进行疏水性分析，结果如图2所示，该蛋白中所有氨基酸疏水性评价均低于零，表明该蛋白的亲水性很好。2.质粒构建及线性化将重组人源Ⅲ型胶原蛋白翻译成碱基序列(SEQNo.3)，采用基于PAS(PCR-basedAccurateSynthesis)的方法合成基因Ⅲα498aa，双酶切连接至ppic9K载体的EcoRI和NotI之间，图3为重组人源Ⅲ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的构建示意图。将获得的重组质粒ppic9K-Ⅲα498aa转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如SEQNo.4所示。SEQNo.4的100-105碱基处及1603-1610碱基处为酶切位点。提取质粒20μg，使用SacI酶切线性化，冻干浓缩待用。37℃消化3h。取5μl，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图4所示。其中M为DNA标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1为SacI酶切；2为回收目的片段。表1酶切线性化体系配制表3.电转毕赤酵母细胞GS115冰浴电转杯，将10μL线性化质粒加入到装有80μL毕赤酵母感受态细胞的1.5mLEP管内，混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中，然后把电转杯冰浴5min。电击条件为：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω，电击时间为4～10msec。电击完成后，将650μL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2mlEP管中，30℃静置培养2h。低速离心收集菌体，全部涂布于MD平板上，30℃恒温培养3～4d。图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。4.PCR鉴定阳性克隆菌株待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有500μLYPD液体培养基离心管，30℃，180r/min过夜培养。挑选10株克隆，分别提取基因组DNA，如图6所示。M为DNA标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1-10：各克隆菌株提取的基因组。使用载体上引物PCR鉴定，结果如图7所示，其中，M：DNA标准品，从下到上100，200，500，75本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组人源III型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ No.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.重组人源III型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQNo.2所示。


2.重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa，核苷酸序列如SEQNo.3所示。


3.重组人源III型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa，核苷酸序列如SEQNo.4所示。


4.根据权利要求3所述的重组人源...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵健烽，高力虎，冯丽萍，黄建民，
申请(专利权)人：江苏江山聚源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32