重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及重组菌株及其在L‑色氨酸制备中的应用。本发明专利技术提供了突变的mg1B蛋白及编码该蛋白的核酸分子，菌株中含有1amB

【技术实现步骤摘要】
重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用。
技术介绍
L-色氨酸是芳香族必需氨基酸的一种，分子式为C11H12N2O2，白色至黄白色晶体或结晶性粉末。无臭或微臭，长时间光照则着色。与酸在暗处加热较稳定。与其他氨基酸、糖类、醛类共存时极易分解。L-色氨酸被广泛应用于医药、食品和饲料等领域。在医药领域，是氨基酸输液的重要组分和重要的医药中间体，可用于孕妇营养补剂和乳幼儿特殊奶粉，用于烟酸缺乏症(糙皮病)治疗药，作为安神药，调节精神节律、改善睡眠。在食品应用领域，色氨酸可用于强化食品，提高风味，也可用于面包促进发酵。在饲料领域，色氨酸还可促进动物的采食、削弱应激反应、改善动物睡眠，还可以增加胎儿和幼仔的抗体、提高乳畜泌乳。降低日粮优质蛋白用量，节约饲料成本，降低日粮蛋白饲料用量，节约配方空间等。L-色氨酸可由化学合成法、蛋白质水解法，酶促转化法、直接发酵法、添加前体发酵法进行生产。目前主流生产方法为直接发酵法。目前工业上生产氨基酸，常已甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，在L-色氨酸发酵生产中也不例外，以糖作为原料添加在培养基中。甘蔗糖蜜中含有大量的淀粉，而很少直接作为原料进行添加，而是在淀粉酶等糖化酶液的作用下，变为淀粉水解液，主要成分是单糖葡萄糖，除此之外，还含有二糖麦芽糖、异麦芽糖或者三糖潘糖等这样的小分子糖。在发酵过程中，当使用淀粉水解液作为原料时，发酵一定程度仅作为主要成分葡萄糖可以被完全消耗，而麦芽糖、异麦芽糖、潘糖等杂糖不能被利用，他们将与L-氨基酸发生美拉德反应，使氨基酸在纯化步骤成为问题，影响提取的收率。因此，降低发酵培养基剩余的杂多糖，可减少提取压力，提高产品纯度，进而节约生产成本，增加效益。早期，已有研究人员发现在酿酒酵母中，存在基因AGT1，其编码Agtlp蛋白质，可将麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖等各自α-糖苷摄入到菌体(Han，E.K.，etal.，MolecularMicrobiology.1995，17，1093.)。异麦芽糖的同化除了需要异麦芽糖转运蛋白以外，还需要异麦芽糖酶存在，研究人员发现在枯草芽孢杆菌中存在malL基因，编码α-糖苷酶，可水解蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖等多糖(MichaelK.Dahl.，etal.，Joumalofbacteriology，1998，2574-2578)。2001年，研究人员发现，在肺炎克雷伯氏菌中，存在aglB和aglA基因，其中aglA基因编码转运蛋白，可将蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、海藻糖等摄入到胞内，aglB基因编码磷酸-α-葡萄糖苷酶，将6-磷酸-α-糖苷分解为葡萄糖等，将多糖进行利用(JohnThompson，etal.，TheJournalofBiologicalChemistry.2001，37415-37425)。大肠杆菌遗传背景更清晰，且培养条件简单，将其作为基因工程菌株具有发酵操作简单的优势，但以大肠杆菌为代表的肠杆菌科细菌群通常不能同化异麦芽糖，也不能确定其是否能够将异麦芽糖摄入到菌体内。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供重组菌株及其在L-色氨酸制备中的应用，该菌株以大肠杆菌为底盘菌，能够利用异麦芽糖，且能够产生L-色氨酸。本专利技术提供了突变的mglB蛋白，其第31位苏氨酸突变为丝氨酸。本专利技术中，突变的mglB蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。本专利技术还提供了编码所述突变的mglB蛋白的核酸分子。本专利技术中，突变的mglB基因的核酸序列如SEQIDNO：6所示。本专利技术所述的蛋白或的核酸分子在构建可利用异麦芽糖的重组宿主中的应用。本专利技术还提供了重组埃希氏菌，其glvA基因和glvC基因过表达，且lamB基因和/或mglB基因发生突变。本专利技术提供的重组埃希氏菌中，glvA基因和glvC基因过表达，且lamB基因和mglB基因发生突变。本专利技术中，过表达的glvA基因和glvC基因来自枯草芽孢杆菌。本专利技术中，所述lamB基因突变使lamB蛋白的第143位酪氨酸突变为亮氨酸；所述mglB基因突变使mglB蛋白的第31位苏氨酸突变为丝氨酸。在本专利技术中，突变lamB基因的核酸序列如SEQIDNO：3所示，突变的lamB蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。本专利技术中，所述重组埃希氏菌为重组的大肠埃希氏菌。一些实施例中，所述重组埃希氏菌的其出发菌株为大肠埃希氏菌SA01。所述的重组埃希氏菌的保藏编号为CGMCCNo.19056。本专利技术还提供了重组埃希氏菌的构建方法，其过表达glvA基因和glvC基因后，利用异麦芽糖进行定向进化；或过表达glvA基因和glvC基因后，采用基因工程手段引入lamB基因和/或mglB基因的突变。本专利技术实施例中，采用定向进化的方法获得突变的lamB基因和/或mglB基因。所述定向进化采用含有异麦芽糖的培养基，其中异麦芽糖的浓度为2g/L。本专利技术还提供了重组埃希氏菌在制备L-色氨酸中的应用。本专利技术提供的重组埃希氏菌异源引入枯草芽孢杆菌的glvA和glvC基因，仍不能利用异麦芽糖，通过定向进化，获得可利用异麦芽糖同时高产L-色氨酸的菌株。经验证，在含2g/l异麦芽糖的M9培养基上验证生长，同出发菌株SA01相比，SMW040菌株(进化)具有明显的生长优势，同时可100％利用异麦芽糖。在同时含有20g/l葡萄糖和6g/l异麦芽糖的培养基中，发酵24h，出发菌株MHZ-0800生长受到一定程度抑制，异麦芽糖没有被消耗，同时产酸仅1.02g/l；而突变菌株MHZ-0812正常生长，OD值未受影响，产酸提高至3.41g/L。本专利技术还提供了一种L-色氨酸的制备方法，其培养本专利技术所述的重组菌株，获得含有L-色氨酸的培养液。本专利技术中，培养所述重组菌株的培养基中，葡萄糖的浓度为20g/L，异麦芽糖的浓度为6g/L。本专利技术中，所述培养重组菌株的培养液包括水和如下浓度的组分：本专利技术中，所述培养重组菌株的条件为37℃，220rpm，pH值为7.0，发酵24h。所述发酵前，还包括菌种活化的步骤，所述活化的培养基包括水和如下浓度的组分：本专利技术提供了突变的mglB蛋白及编码该蛋白的核酸分子，菌株中含有lamBTyr143Leu，mglBThr31Ser突变，则该菌株被赋予异麦芽糖的利用能力。在过表达glvA基因和glvC基因的菌株中引入上述突变，则该菌株具有利用异麦芽糖能力且可以产生L-色氨酸，本专利技术进一步的提供了利用该微生物生产L-色氨酸的方法。更具体地，本专利技术涉及通过改造加进化的方式可利用异麦芽糖，从而更具有提高L-色氨酸生产能力的大肠杆菌，以及利用该微生物生产L-色氨酸的方法。生物保藏说明生物材料MHZ-0812，分类命名：大肠埃希氏菌Escherichiacoli.，于2019年11月29日保藏在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.突变的mglB蛋白，其第31位苏氨酸突变为丝氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.突变的mglB蛋白，其第31位苏氨酸突变为丝氨酸。


2.编码权利要求1所述突变的mglB蛋白的核酸分子。


3.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的核酸分子在构建可利用异麦芽糖的重组宿主中的应用。


4.重组埃希氏菌，其过表达glvA基因和glvC基因，且lamB基因和/或mglB基因发生突变；
所述lamB基因突变使lamB蛋白的第143位酪氨酸突变为亮氨酸；
所述mglB基因突变使mglB蛋白的第31位苏氨酸突变为丝氨酸。


5.根据权利要求4所述的重组埃希氏菌，其特征在于，其出发菌株为大肠埃希氏菌SA01。


6.根据权利要求4或5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亚，程江红，张晓云，吴涛，赵津津，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13