组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种组成型表达猪胃蛋白酶原C(PGC)的毕赤酵母工程菌株。本发明专利技术将经人工改造的猪胃蛋白酶原C(PGC)基因连接到毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA，并导入毕赤酵母菌株中，经筛选鉴定得到不需甲醇诱导即可高效组成型分泌表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌株。该工程菌株在培养基YPD中分泌表达猪胃蛋白酶原C，连续培养48h后酶活为180U﹒mL

Constitutive expression of porcine pepsinogen C in Pichia pastoris and its application

【技术实现步骤摘要】
组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体而言，本专利技术涉及一种组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌及其应用。
技术介绍
胃蛋白酶是蛋白酶中的一种，广泛应用于医药、食品、轻工以及生物技术等各个领域。目前其主要来源于动物(如牛、羊、猪等)的胃组织，但是动物源胃蛋白酶存在较多问题，例如易容受动物脏器资源的限制；胃蛋白酶产量小、价格高，且酶活性低、质量不稳定；容易产生有害化学物质残留，例如动物组织的有毒有害因子。因此，以上因素限制了胃蛋白酶的广泛使用。通过基因工程方法，构建重组胃蛋白酶高产工程菌，是解决胃蛋白酶目前应用“瓶颈”的有效方法，该方法通过大规模发酵生产，可大大降低成本，并且纯化得到的酶产物残留少，纯度高，具有环保、不受原料限制等优点。然而目前依然缺少高效表达有活性的胃蛋白酶的工程菌，商品化的重组胃蛋白酶还很少。胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体，在酸性条件(例如pH5.4)下可自催化反应生成有活性的胃蛋白酶。目前针对其前体胃蛋白酶原构建基因工程菌是工业上获得胃蛋白酶的有效方法。目前对重组猪胃蛋白酶原的研究主要集中在猪胃蛋白酶原A上，而对猪胃蛋白酶原C的研究报道很少。因此有必要构建表达猪胃蛋白酶原C的重组菌株。综合比较可表达重组蛋白的不同宿主，由于毕赤酵母表达的蛋白易于纯化，产量高，目前研究使用较为广泛。毕赤酵母中表达异源蛋白通常采用甲醇诱导的方式，这样可以使菌株生长期及生产期分开，在前期实现菌体大量生长，在后期实现蛋白高效表达，但是诱导型菌株生产时也存在诸多不利，如甲醇易挥发、有毒、容易造成安全及环境问题；另外，当应用于食品、医药行业时，甲醇残留是要极力避免的。因此，如何避免甲醇的使用并具有较高的猪胃蛋白酶原C产量，是目前亟需解决的问题。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种组成型表达猪胃蛋白酶原C(PGC)的毕赤酵母工程菌，实现了使用组成型表达载体来完成猪胃蛋白酶原C在毕赤酵母中的组成型表达，不需甲醇诱导，实现了猪胃蛋白酶原C更加安全有效的生产，并同时获得了较高的猪胃蛋白酶原C产量。一方面，本专利技术提供了一种组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母(Pichiapastoris)为宿主、pGAPZαA为载体表达猪胃蛋白酶原C(PGC)。其中，所述猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列由SEQIDNO.:2所示。其中，编码所述猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列由SEQIDNO.:1所示。另一方面，本专利技术提供了构建上述组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌的方法，所述方法包括：(1)人工合成编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列；(2)将步骤(1)获得的编码猪胃蛋白酶原C的所述多核苷酸序列连接到毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA上，得到重组质粒pGAPZαA-PGC；(3)将步骤(2)获得的重组质粒pGAPZαA-PGC导入毕赤酵母菌株中，从而得到所述毕赤酵母工程菌。再一方面，本专利技术提供了一种生产猪胃蛋白酶原C的方法，所述方法包括利用上述毕赤酵母工程菌或由上述方法构建的毕赤酵母工程菌来进行发酵，从而获得所述猪胃蛋白酶原C。另一方面，本专利技术还提供由上述毕赤酵母工程菌或由上述方法构建的毕赤酵母工程菌生产的、或由上述方法生产的猪胃蛋白酶原C及其经活化后有活性的猪胃蛋白酶C。本专利技术的猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列由SEQIDNO.:2所示。所述猪胃蛋白酶原C在pH5.4以下的酸性条件下可活化得到有活性的猪胃蛋白酶C。所述猪胃蛋白酶C与动物源的猪胃蛋白酶(不同胃蛋白酶混合物)的活性一致且为单一胃蛋白酶C。又一方面，本专利技术提供了上述毕赤酵母工程菌或由上述方法构建的毕赤酵母工程菌在食品、饲料或医药方面的应用。本专利技术还提供了本专利技术的猪胃蛋白酶原C及其经活化后得到的猪胃蛋白酶C在食品、饲料或医药方面的应用本专利技术的有益效果：本专利技术的组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌实现了猪胃蛋白酶原C在毕赤酵母中的高组成型表达，在基本培养基中连续培养48h，酶活可达180U﹒mL-1，为猪胃蛋白酶的组成型生产奠定了基础，具有良好的工业应用前景。本专利技术的猪胃蛋白酶原C可在酸性条件下自催化反应生成有活性的胃蛋白酶C，可广泛应用于食品、饲料和医药等行业，具有良好的商业应用前景。附图说明图1是根据本专利技术的实施方式的pGAPZαA-PGC的质粒图谱。图2为构建pGAPZαA-PGC质粒过程中的酶切结果；其中泳道1为pGAPZαA，泳道2为pGAPZαA-PGC，泳道3为pGAPZαA-PGC经EcoRI和NotI双酶切的产物。图3是猪胃蛋白酶原C的SDS-PAGE分析结果；其中泳道1和2分别为PichiapastorisGS115-pGAPZαA-PGC发酵48h和24h的上清液。图4为人工合成的编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列(SEQIDNO.:1)。图5为本专利技术的猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列(SEQIDNO.:2)。具体实施方式本专利技术人通过将人工合成的毕赤酵母密码子偏好的编码猪胃蛋白酶原C(PGC)的多核苷酸序列连接至组成型载体pPGAPZαA中并导入毕赤酵母(Pichiapastoris)中，获得了组成型表达猪胃蛋白酶原C(PGC)的毕赤酵母工程菌，实现了不需甲醇诱导即可生产酶活高达180U·mL-1的猪胃蛋白酶原C。在一个实施方式中，本专利技术提供了一种组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌，所述菌株以毕赤酵母(Pichiapastoris)为宿主、pGAPZαA为载体表达猪胃蛋白酶原C(PGC)。其中，所述猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列由SEQIDNO.2所示。基于酵母偏爱密码子对编码猪胃蛋白酶原C的核苷酸序列进行优化。在优选的实施方式中，所述编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列由SEQIDNO.:1所示。其中，所述毕赤酵母选自巴斯德毕赤酵母，优选毕赤酵母GS115(PichiapastorisGS115)。在优选的实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115，由此得到的毕赤酵母工程菌称为PichiapastorisGS115-pGAPZαA-PGC。在一个实施方式中，本专利技术提供了构建本专利技术的组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌的方法，所述方法包括：(1)人工合成编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列；(2)将步骤(1)获得的编码猪胃蛋白酶原C的所述多核苷酸序列连接到毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA上，得到重组质粒pGAPZαA-PGC；(3)将步骤(2)获得的重组质粒pGAPZαA-PGC导入毕赤酵母菌株中得到所述毕赤酵母工程菌。其中，猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列由SEQIDNO.:2所示。在优选的实施方式中，所述编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列由SEQIDNO.1所示。在一个实施方式中，在步骤(2)中，可使用本领域技术人员已知的各种方法将所述编码猪胃蛋白酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主、以pGAPZαA为载体表达所述猪胃蛋白酶原C。/n

【技术特征摘要】
1.一种组成型表达猪胃蛋白酶原C的毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母(Pichiapastoris)为宿主、以pGAPZαA为载体表达所述猪胃蛋白酶原C。


2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述猪胃蛋白酶原C的氨基酸序列由SEQIDNO.:2所示。


3.根据权利要求1或2所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，编码所述猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列由SEQIDNO.:1所示。


4.根据权利要求1-3中任一项所述毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。


5.构建权利要求1-4中任一项所述的毕赤酵母工程菌的方法，所述方法包括：
(1)人工合成编码猪胃蛋白酶原C的多核苷酸序列；
(2)将步骤(1)中获得的所述多核苷酸序列连接到表达载体pGAPZαA上，得到重组质粒pGAPZαA-PGC；以及
(3)将步骤(2)中获得的所述重组质粒pGAPZαA-PGC导入毕赤酵母中，得到所述毕赤酵母工程菌。


6.根据权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：金渭武，陈博，郑晓卫，杨鑫，孙铁虎，
申请(专利权)人：中粮生物科技北京有限公司，中粮营养健康研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11