负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子及其制备方法与应用，负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子是将肿瘤抗原通过迈克尔加成和席夫碱反应共价连接到聚多巴胺纳米颗粒的表面上制备而成；其中，肿瘤抗原包括但不限于特异的肿瘤抗原肽段、肿瘤细胞裂解物、特异的肿瘤抗原DNA片段及佐剂CpG中的一种或多种。本发明专利技术制备得到的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子具有良好的生物相容性，可以有效激活体内的抗肿瘤免疫，显著地抑制肿瘤细胞的生长，还能改善肿瘤免疫抑制微环境，进一步增强肌体的抗肿瘤活性；可用于肿瘤的免疫治疗；制备方法温和简单、无污染。

Preparation and application of tumor antigen loaded polydopamine nanoparticles

【技术实现步骤摘要】
负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物材料
，具体涉及一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子及其制备方法与应用。
技术介绍
全世界每年死于恶性肿瘤者大约880万人，新发病例1400万。最新统计资料显示，近二十年来，中国癌症死亡率上升了近百分之三十，每四、五个死亡者中就有一个死于癌症，居死亡原因前三位。虽然临床上应用手术治疗、放化疗等方法治疗恶性肿瘤，但依然有不少患者出现术后复发，耐受不了放化疗的毒副作用等状况。新兴的肿瘤免疫治疗给中晚期肿瘤患者带来希望，但目前临床受益不明显。肿瘤免疫治疗主要有两方面的障碍：一是无法有效激活体内的抗肿瘤免疫，二是很难克服肿瘤微环境对已经激活的免疫杀伤细胞的免疫抑制作用。有效的抗原呈递是抗肿瘤免疫的关键先决条件，其需要激活抗原提呈细胞(APC)，而树突状细胞(DC细胞)是最强的抗原提呈细胞。通常大多数抗原被DC细胞吞噬后不能从溶酶体中逃逸，最终由MHCII分子提呈抗原，其仅引发体液免疫。为了诱导对抗肿瘤免疫至关重要的特异性的细胞免疫，即细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产生，抗原必须由MHCI分子提呈，并同时在DC细胞表面表达相应的共刺激分子。因此，有必要设计一种肿瘤抗原递送系统，其能够向DC细胞质中递送肿瘤抗原，促进在DC细胞质中的交叉呈递以激活MHCI介导的呈递，并最终诱导细胞免疫，激活CTL对肿瘤的杀伤活性。负载肿瘤抗原的纳米颗粒递送系统由于具有更容易被DC吸收和更有效地促进抗原呈递等优点受到越来越多的关注。纳米颗粒递送有可能弥补传统肿瘤疫苗的缺陷。尽管已经将多种纳米材料用于抗原递送，但是那些纳米材料的表面改性仍然具有挑战性。由于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)或聚乳酸(PLA)纳米粒子固有的化学惰性，一些偶联剂或活化的连接臂是抗原修饰所必需的。此外，改性过程通常是多步反应，随后的纯化效率低且繁琐。生物安全问题也是纳米材料开发和医学应用中的主要问题。阳离子聚合物，如壳聚糖(CS)和聚乙烯亚胺(PEI)，可有效传递抗原并引发免疫反应，但由于它们造成细胞膜受损，故其可能具有较高的细胞毒性。因此，研发作为抗原递送系统的高效、无毒生物材料仍然是一个瓶颈。聚多巴胺(PDA)纳米粒子由于其优异的生物相容性，已迅速应用于生物成像，光热疗法和药物传递系统等许多生物学领域。作为单体的多巴胺不仅是关键神经递质之一，也是神经系统和免疫系统之间重要的信号分子。作为细胞外信息分子，多巴胺通过与免疫细胞上的多巴胺受体相互作用来调节免疫系统，并能触发多个关键T细胞功能。此外，研究发现多巴胺通过激活内皮细胞和肿瘤细胞上的多巴胺受体使其具有抗血管生成和抗癌活性。因此，作为多巴胺自聚物的PDA将可能成为肿瘤免疫疗法中的抗原递送载体的优异材料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效的肿瘤抗原递送系统，即负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子，即将肿瘤抗原共价连接到聚多巴胺纳米粒子表面而成；其中，肿瘤抗原包括但不限于特异的肿瘤抗原肽段、肿瘤细胞裂解物、特异的肿瘤抗原DNA片段及佐剂CpG中的一种或多种。本专利技术的第二目的是提供一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，包括步骤：将聚多巴胺纳米粒子溶液与肿瘤抗原溶液混合，在0～37℃条件下反应1～24小时；将反应得到的产物离心后洗涤，收集得到负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子。需要说明的是，本专利技术是将肿瘤抗原通过迈克尔加成和席夫碱反应共价连接到聚多巴胺纳米颗粒的表面以形成负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子；负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备过程需要在0～37℃有氧条件下进行。将反应得到的产物离心，能离下负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的任何转速和时间都可，在实验过程中，通常采用的离心力为5000～29000g，离心的时间为3～30分钟。优选地，聚多巴胺纳米粒子和肿瘤抗原的质量比为1：(0.1～10)；肿瘤抗原溶液的质量浓度为0.1～50mg·mL-1。优选地，还包括在聚多巴胺纳米粒子溶液与肿瘤抗原溶液的混合溶液中加入介质溶液得到混合反应体系的步骤；其中，介质溶液为水溶液或者有机物/水混合溶液。需要说明的是，通过加入介质溶液，可以增加肿瘤抗原在聚多巴胺纳米粒子的负载量，尤其是加入有机物/水混合溶液。进一步优选地，水溶液为盐酸水溶液、硫酸水溶液、磷酸水溶液、醋酸水溶液、氯化钠水溶液、磷酸缓冲液(PBS)、醋酸缓冲液、碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、氢氧化钠水溶液和氢氧化钾水溶液中的一种或多种；水溶液中溶质(如HCl、H2SO4、H3PO4、CH3COOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、KOH等)的质量与混合反应体系的质量的比值为(0.000001～0.1)：100；水溶液的pH值为2～9。进一步优选地，介质溶液为有机物/水混合溶液时，混合反应体系中有机物的质量分数为0.01％～10％；有机物选自甲醛、戊二醛、京尼平、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)、3-(2-吡啶二硫基)丙酸氮-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐中的一种或多种；3-(2-吡啶二硫基)丙酸氮-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐为Sulfo-SPDP或Sulfo-LC-SPDP。需要说明的是，在实验过程中，有机物/水混合溶液中有机物的质量分数可以为0.001％～40％。优选地，负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子用水重悬后储存在0～12℃备用；水优选为去离子水。优选地，聚多巴胺纳米粒子溶液的制备方法包括步骤：将多巴胺盐酸盐溶解在水中，得到多巴胺盐酸盐溶液；在37～70℃搅拌下加入氢氧化钠水溶液，得到混合反应体系；随后反应1～6小时；将反应得到的产物离心后洗涤，收集得到聚多巴胺纳米粒子；将聚多巴胺纳米粒子重悬于水中，得到聚多巴胺纳米粒子溶液。需要说明的是，聚多巴胺纳米粒子溶液的制备中的反应依次包括氧化、重排和聚合等。将反应得到的产物离心，能离下聚多巴胺纳米粒子的任何转速和时间都可以，在实验过程中，通常采用的离心力为5000～15000g，离心的时间为3～25分钟。重悬采用的水的体积可多可少，只要能没过纳米粒子即可；如需要接肿瘤抗原分份时，可根据实际需求调整聚多巴胺纳米粒子的悬浮体积；在实验过程中，通常重悬采用的水的体积与多巴胺盐酸盐的质量的比值为(0.15～10)mL：10mg。进一步优选地，多巴胺盐酸盐溶液的浓度为1～60mg·mL-1；混合反应体系中，氢氧化钠的质量分数为0.0001％～0.1％；水为去离子水。需要说明的是，在实验过程中，氢氧化钠水溶液的摩尔浓度可以为0.1～2mol·L-1；多巴胺盐酸盐的质量与氢氧化钠的质量的比值可以为1：(0.1～500)。本专利技术的第三目的是提供一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子在肿瘤的免疫治疗领域中的应用。本专利技术提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本专利技术以聚多巴胺纳米粒子为基础，负载肿瘤抗原，制备高效、安全和高负载力的肿瘤抗原递送系统，荷瘤动物体内实验提示负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子一方面能有效的激活了体内的抗肿瘤免疫，显著本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子，其特征在于：/n所述负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子是将肿瘤抗原共价连接到聚多巴胺纳米粒子表面而成；其中，所述肿瘤抗原包括但不限于特异的肿瘤抗原肽段、肿瘤细胞裂解物、特异的肿瘤抗原DNA片段及佐剂CpG中的一种或多种。/n

【技术特征摘要】
1.一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子，其特征在于：
所述负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子是将肿瘤抗原共价连接到聚多巴胺纳米粒子表面而成；其中，所述肿瘤抗原包括但不限于特异的肿瘤抗原肽段、肿瘤细胞裂解物、特异的肿瘤抗原DNA片段及佐剂CpG中的一种或多种。


2.权利要求1所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将聚多巴胺纳米粒子溶液与肿瘤抗原溶液混合，在0～37℃条件下反应1～24小时；将反应得到的产物离心后洗涤，收集得到所述负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子。


3.根据权利要求2所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于：
聚多巴胺纳米粒子和肿瘤抗原的质量比为1：(0.1～10)；
所述肿瘤抗原溶液的质量浓度为0.1～50mg·mL-1。


4.根据权利要求2所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于：
还包括在聚多巴胺纳米粒子溶液与肿瘤抗原溶液的混合溶液中加入介质溶液得到混合反应体系的步骤；其中，所述介质溶液为水溶液或者有机物/水混合溶液。


5.根据权利要求4所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于：
所述水溶液为盐酸水溶液、硫酸水溶液、磷酸水溶液、醋酸水溶液、氯化钠水溶液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、氢氧化钠水溶液和氢氧化钾水溶液中的一种或多种；
所述水溶液中溶质的质量与所述混合反应体系的质量的比值为(0.000001～0.1)：100；
所述水溶液的pH值为2～9。

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【专利技术属性】
技术研发人员：张海玲，冷希岗，王晓莉，王宁，杨影，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12