水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法技术

本发明专利技术专利属于水产品质量安全检测技术领域，涉及一种高效检测水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫残留量的方法。所述检测方法为高效液相色谱‑质谱联用的检测方法。该检测方法以目标化合物相应的同位素为内标，待检产品经提取液乙腈提取，中性氧化铝固相萃取柱净化，0.22μm微孔滤膜过滤后用高效液相色谱‑质谱联用仪检测。本发明专利技术检测技术通过对不同水产品进行试验，回收率均可达到85％‑120％，四种检测指标检出限均可达到0.5μg/kg，标准曲线r值均在0.99以上。与现有检测方法相比，该方法使用试剂少，前处理成本低，步骤简单、易上手，检测参数齐全，非常适用于水产品的大批量检测。

Determination of malachite green, cryptomalachite green, crystal violet and cryptocrystalline violet in aquatic products

【技术实现步骤摘要】
水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法
本专利技术专利属于水产品质量安全检测
，涉及一种高效检测水产品中孔雀石绿、含隐色孔雀石绿、结晶紫、含隐色结晶紫残留量的方法。
技术介绍
孔雀石绿和结晶紫属于人工合成的三苯甲烷类碱性工业染料，因其可以消毒杀菌且价格低廉而广泛地用于水产品的养殖过程，主要用来预防和治疗各类水产动物的水霉病、锶霉病、寄生虫病、小瓜虫病、指环虫病、斜管虫病、三代虫病及其他一些细菌性疾病等，也可用于水产品的输入和水产品暂养等过程，以延长水产品特别是鱼类产品的存活时间。孔雀石绿和结晶紫在被鱼类吸收后，会代谢还原为脂溶性的隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，在鱼类的脂肪组织中稳定残留，其化学官能团“三苯甲烷＂被证明具有高毒、高残留、致癌、致畸、致突变等毒副作用，危害食用者身体健康，同时含有孔雀石绿和结晶紫的废水排放会污染水环境。鉴于此，很多国家都禁止其作为渔场杀菌剂，并规定在食用水产品中禁止检出孔雀石绿和结晶紫，我国也于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中，要求在动物性食品中不得检出。目前针对孔雀石绿和结晶紫残留量检测方法主要有高效液相色谱法、液质联用法及速测技术，国内常用标准主要有GB/T19857-2005、GB/T20361-2006、SC/T3021-2004。GB/T20361-2006高效液相色谱检测法主要原理是用硼氢化钾将孔雀石绿和结晶紫还原为其相应的代谢产物隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，乙腈乙酸铵缓冲混合液提取，二氯甲烷液液萃取，固相萃取柱净化后上机检测，该方法前处理复杂繁琐，容易造成损失，所用试剂种类繁多，在应对大批量样品检测时效率低下。GB/T19857-2005液相色谱串联质谱法及高效液相色谱法主要原理是利用乙腈乙酸铵缓冲混合液提取后，乙腈再次提取，溶液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝柱和阳离子固相柱净化后上机检测，本法检测灵敏度高，但同样存在前处理复杂繁琐的问题，且所用试剂及前处理仪器众多，前处理成本高，处理过程对专业检测人员的专业技术要求较高，检测结果质量很难控制，SC/T3021-2004只能针对性检测水产品中的孔雀石绿和隐色孔雀石绿，对结晶紫和隐色结晶紫未做试验。另外，针对孔雀石绿和结晶紫的检测方法，还有一类是以酶标法和富集法为主的快速检测技术，如浊点萃取技术和协同萃取技术等，此类方法不需要大型仪器辅助检测，且速度快，一般半小时之内即可出结果，但缺点是定量不准确，检出限较高，只能进行初筛，很难达到国家标准要求指标。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种使用试剂少、步骤简单、前处理成本低，重现性好、灵敏度高、可大批量且同时检测水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫四种检测参数残留量的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：一种水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法，所述检测方法为高效液相色谱-质谱联用的检测方法。所述水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法，包括如下步骤：(1)样品前处理；(2)基质加标标准工作曲线的制备；(3)空白试验：(4)采用高效液相色谱-质谱联用仪测定，计算孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫含量。所述样品前处理包括如下步骤：(1)称取5.00g待检水产品于50mL离心管中，加1.0μg/mL的孔雀石绿-D5和隐色孔雀石绿-D6混合内标工作液50uL作为内标，旋涡混合30s，加10mL乙腈提取，旋涡振荡1min，超声(频率：40KHz)提取10min，4000rpm离心5min，将上清液移入15mL离心管备用；将中性氧化铝小柱安装在固相萃取柱上，用5mL乙腈活化，取离心后的上清液5mL到已活化好的中性氧化铝柱，收集流出液，过0.22μm滤膜到10mL的干净离心管中，在离心管中取0.5mL滤液到上机瓶，再加入0.5mL实验室超纯水到上机瓶，摇匀，供高效液相色谱-质谱联用仪测定。所述基质加标标准工作曲线的制备包括如下步骤：(2)将10.0μg/mL的混合标准工作液(含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫)用乙腈逐级稀释成浓度为10.0μg/mL、4.0μg/mL、2.0μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL的混合标准中间液；称取不含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的空白水产样品5.00g，根据所需标准曲线浓度梯度(0.5μg/kg～100.0μg/kg)加入对应混合标准中间液50uL，按照样品前处理步骤的方法与待检水产品同时进行提取和净化，供高效液相色谱-质谱联用仪测定，根据测定结果绘制标准曲线。上述的水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法中，所述标准曲线浓度梯度为0.5μg/kg，1.0μg/kg，2.0μg/kg，5.0μg/kg,，10.0μg/kg，20.0μg/kg，40.0μg/kg，100.0μg/kg，每个梯度对应溶液混合内标浓度为10.0μg/kg。所空白试验包括如下步骤：(3)除不加试样(即不加水产品样品5.00g)外，其余均按照样品前处理步骤进行，制得空白试验溶液。所述高效液相色谱-质谱联用仪的分析检测条件为：①色谱条件：色谱柱：ACQUITYCSHTMC181.7μm2.1x100mmColumn；流动相：A:0.1％的甲酸水溶液(内含乙酸铵浓度为5mmol/L)、B:甲醇；流速：0.2mL/min；进样量为3uL；柱温：40℃；溶剂梯度(时间min/A/B)：0.01/90/10；1.00/10/90；5.00/10/90；5.10/90/10；6.00/90/10。②质谱条件：离子源：电喷雾离子源(正离子扫描模式)；扫描方式：多反应监测模式；雾化气：氮气；碰撞气：氩气；毛细管电压：0.35kv；源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流：1000L/Hr；锥孔气流：30L/Hr；驻留时间：0.028s。③四种目标物及两种内标物的监测离子对参数：孔雀石绿：母离子329.1，定量离子313.1，碰撞能量36，锥孔电压65，定性离子208.0，碰撞能量36，锥孔电压65；隐色孔雀石绿母离子331.2，定量离子239.1，碰撞能量30，锥孔电压36，定性离子316.2，碰撞能量22，锥孔电压36；结晶紫母离子372.2，定量离子356.2，碰撞能量40，锥孔电压56，定性离子235.1，碰撞能量58，锥孔电压56；隐色结晶紫母离子374.2，定量离子358.2，碰撞能量30，锥孔电压55，定性离子238.3，碰撞能量32，锥孔电压55；孔雀石绿-D5母离子334.1，定量离子318.1，碰撞能量40，锥孔电压65；隐色孔雀石绿-D6母离子337.2，定量离子322.1，碰撞能量22，锥孔电压50。所述孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫含量计算方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法，其特征在于，所述检测方法为高效液相色谱-质谱联用的检测方法。/n

【技术特征摘要】
1.一种水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法，其特征在于，所述检测方法为高效液相色谱-质谱联用的检测方法。


2.如权利要求1所述的一种水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品前处理；
(2)基质加标标准工作曲线的制备；
(3)空白试验：
(4)采用高效液相色谱-质谱联用仪测定，计算孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫含量。


3.如权利要求2所述的一种水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法，其特征在于，所述样品前处理包括如下步骤：
(1)称取5.00g待检水产品于50mL离心管中，加1.0μg/mL的孔雀石绿-D5和隐色孔雀石绿-D6混合内标工作液50uL作为内标，旋涡混合30s，加10mL乙腈提取，旋涡振荡1min，超声(频率：40KHz)提取10min，4000rpm离心5min，将上清液移入15mL离心管备用；将中性氧化铝小柱安装在固相萃取柱上，用5mL乙腈活化，取离心后的上清液5mL到已活化好的中性氧化铝柱，收集流出液，过0.22μm滤膜到10mL的干净离心管中，在离心管中取0.5mL滤液到上机瓶，再加入0.5mL实验室超纯水到上机瓶，摇匀，供高效液相色谱-质谱联用仪测定。


4.如权利要求2所述的一种水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法，其特征在于，所述基质加标标准工作曲线的制备包括如下步骤：
(2)将混合标准工作液(含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫)用乙腈逐级稀释成浓度为10.0μg/mL、4.0μg/mL、2.0μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL的混合标准中间液；称取不含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的空白水产样品5.00g，根据所需标准曲线浓度梯度(0.5μg/kg～100.0μg/kg)加入对应混合标准中间液50uL，按照样品前处理步骤的方法与待检水产品同时进行提取和净化，供高效液相色谱-质谱联用仪测定，根据测定结果绘制标准曲线。


5.如权利要求4所述的一种水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法，其特征在于，所述标准曲线浓度梯度为0.5μg/kg，1.0μg/kg，2.0μg/kg，5.0μg/kg,，10.0μg/kg，20.0μg/kg，40.0μg/kg，100.0μg/kg，每个梯度对应溶液混合内标浓度为10.0μg/kg。


6.如权利要求2所述的一种水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法，其特征在于，所空白试验包括如下步骤：
(3)除不加试样(即不加水产品样品5.00g)外，其余均按照样品前处理步骤进行，制得空白试验溶液。


7.如权利要求2所述的一种水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱-质谱联用仪的分析检测条件为：
①色谱条件：
色谱柱：ACQUITYCSHTMC181.7μm2.1x100mmColumn；流动相：A:0.1％的甲酸水溶液(内含乙酸铵浓度为5mmol/L)、B:甲醇；流速：0.2mL/min；进样量为3uL；柱温：40℃；溶剂梯度(时间min/A/B)：0.01/90/10；1.00/10/90；5.00/10/90；5.10/90/10；6.00/90/10。
②质谱条件：
离子源：电喷雾离子源(正离子扫描模式)；扫描方式：多反应监测模式；雾化气：氮气；碰撞气：氩气；毛细管电压：0.35kv；源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流：1000L/Hr；锥孔气流：30L/Hr；驻留时间：0.028s。
③四种目标物及两种内标物的监测离子对参数：
孔雀石绿：母离子329.1，定量离子313.1，碰撞能量36，锥孔电压65，定性离子208.0，碰撞能量36，锥孔电压65；隐色孔雀石绿母离子331.2，定量离子239.1，碰撞能量30，锥孔电压36，定性离子316.2，碰撞能量22，锥孔电压36；结晶紫母离子372.2，定量离子356.2，碰撞能量40，锥孔电压56，定性离子235.1，碰撞能量58，锥孔电压56；隐色结晶紫母离子374.2，定量离子358.2，碰撞能量30，锥孔电压55，定性离子238.3，碰撞能量32，锥孔电压55；孔雀石绿-D5母离子334.1，定量离子318.1，碰撞能量40，锥孔电压65；隐色孔雀石绿-D6母离子337.2，定量离子322.1，碰撞能量22，锥孔电压50。


8.如权利要求2所述的一种水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测方法，其特征在于，所述孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫含量计算方法为：
根据样品前处理步骤测得的样品制备的峰面积值，从基质加标标准工作曲线的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：穆小婷，韩文节，欧志鹏，华四妹，陈智标，谢卫兵，谢泽纯，廖侦成，
申请(专利权)人：清远市农产品质量检验检测中心，
类型：发明
国别省市：广东;44