提供了一种高氮素利用转基因大豆8c‑ox‑2外源插入片段的侧翼序列及其应用，属于基因育种技术领域。本发明专利技术提供的氮高效转基因大豆事件8c‑ox‑2经鉴定插入位点侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。本发明专利技术提供用于检测该旁支序列的引物，如SEQ ID No.3～6所示。本发明专利技术提供的侧翼序列及其鉴定适用于氮高效转基因大豆8c‑ox‑2(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。
Flanking sequence, obtaining method and application of 8c-ox-2 foreign insertion fragment of high nitrogen utilization transgenic soybean
【技术实现步骤摘要】
一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用
本专利技术属于基因育种
，尤其涉及一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用。
技术介绍
转基因育种具有性状改良精准、周期短等特点。利用转基因技术进行作物氮素利用效率改良可以改善氮肥过度施用的现状，提高农业的可持续发展能力。细胞自噬是营养物质再动员的主要形式。在拟南芥中证明很多自噬相关基因ATGs的突变都会导致植物早衰，表现出对氮/碳胁迫更为敏感的表型((Doelling等，2002；Hanaoka等，2002；Yoshimoto等，2004；Thompson等，2005；Xiong等，2005；Chung等，2010)。GmATG8c蛋白是细胞自噬关键蛋白，在自噬体的形成和延展过程中发挥重要的功能(XiaT,XiaoD,LiuD,ChaiW,GongQ,etal.HeterologousexpressionofATG8cfromsoybeanconferstolerancetonitrogendeficiencyandincreasesyieldinArabidopsis.PLoSONE,2012,7:e37217.doi:10.1371)。将含有携带大豆自噬关键基因表达盒35S:GmATG8c的植物表达载体通过农杆菌介导法转入到大豆基因组中，获得了一个氮高效转基因大豆事件8c-ox-2(徐伟,刘生,游翔,梅圆圆,王丹,王宁宁.过表达GmATG8c基因提高大豆的低氮耐受性和产量.植物生理学报，2017，2(1)，241-247)，并正在进行中间试验阶段的安全评价。对转基因大豆进行转化事件特异性检测，能更好的对转基因大豆进行监管管理，而外源插入片段的侧翼序列，是进行监督管理的一个重要指标。因此需要获得转基因大豆8c-ox-2的侧翼序列，但是现有技术中并未报道有转基因大豆8c-ox-2的侧翼序列。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用，本专利技术提供的侧翼序列可应用于转基因大豆的检测。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示。本专利技术还提供了上述技术方案所述的侧翼序列的获取方法，包括以下步骤：1)提取转基因大豆8c-ox-2的基因组DNA，对所述基因组DNA进行基因组重测序，根据重测序结果确定转基因大豆8c-ox-2的T-DNA序列插入到大豆基因组第15号染色体上2779776～2781294碱基之间；2)提取转基因大豆8c-ox-2的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；3)将所述步骤2)得到的扩增产物进行测序，将得到的测序结果同phytozome数据库中大豆基因组序列和步骤1)得到的T-DNA序列进行序列比对，得到侧翼序列。优选的，所述PCR扩增使用的引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3～6所示，所述SEQIDNo.3～4为扩增SEQIDNo.1的引物，所述SEQIDNo.5～6为扩增SEQIDNo.2的引物。优选的，所述PCR扩增的程序为94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。优选的，所述PCR扩增使用的体系每25μl包括基因组DNA100ng，10×buffer2.5μl，2.5mMdNTPs2μl，10μM引物各1μl，5U/μlTaq酶0.2μl，ddH2O补至25μl。本专利技术还提供了上述引物在检测转基因大豆中的应用。本专利技术通过基因组重测序结合基因组PCR的方法获得了高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示。根据获得上述侧翼序列的引物，可以检测该侧翼序列，进而建立针对氮高效转基因大豆8c-ox-2事件的鉴定方法，通过普通PCR扩增得到了包含载体片段又包含大豆基因组信息的序列，本专利技术提供的侧翼序列和引物适用于对转基因大豆8c-ox-2(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其他制品)的检测。附图说明图1为载体构建示意图；图2为氮高效转基因大豆8c-ox-2的T2代植株的PCR检测，其中M，GenStarD2000plusDNAmarker；TL，受体大豆天隆一号阴性对照；1-6，6株转基因植株；-，ddH2O阴性对照；+，质粒pCAMBIA3301-GmATG8c为模板的阳性对照；图3为温室石英砂低氮条件下8c-ox-2株系耐低氮表型分析；图4为T5代转基因大豆8c-ox-2外源T-DNA左边界序列特异性PCR检测，其中M：GenStarD2000plusDNAmarker；TL：受体大豆天隆一号阴性对照；1，2，3，4，5：5株T5代8c-ox-2转基因植株；+：:1株T2代8c-ox-2转基因植株；-：ddH2O阴性对照；图5为T5代转基因大豆8c-ox-2外源T-DNA右边界序列特异性PCR检测，其中M：GenStarD2000plusDNAmarker；TL：受体大豆天隆一号阴性对照；1，2，3，4，5：5株T5代8c-ox-2转基因植株；+：:1株T2代8c-ox-2转基因植株；-：ddH2O阴性对照。具体实施方式本专利技术提供了一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示，具体如下：SEQIDNo.1：AGAGCTTGAAGTGGGTTTAACGTGGAAAGTGGAATCCACCTTTGCCTATGCGAAACGTCGGAGTTGAAATGACAAAGAAAAGGATAAAAGCGAACCCCCATAAAAATTGTTTCGGCTATTGTAACATG；SEQIDNo.2：TTACTTTCTATCTGAAAAGGGTGGCCAGTAAAAGCAGGGGGAGAAATTGTAAATGACCTTTTCCCTGAAGCCTTATCATGCTTTTTTCTCAGAAAGATTTTCAGTCTTATCAGTTCTTAGTTCTTACCATTGTATTGGCTTTTCCATTTGAACTAATCTGATTGGATTTTCTCATTTGTTGTTCCTGCCAATTAAATTGTTGTAATGGCATGTTTAGTTTTTGCTAGCTTTGTCTTTAATGTAGTTGGGTAGTTGGTACTGTAAATTTAACTCTCTGCTATTGTGATTTTGCTTACTGGTTTTGCATATGGTTCCCATGGTTATTAAAACGAGGAAATGAAAATAATGTGGTCCTAGAAGA。在本专利技术中，所述转基因大豆8c-ox-2优选按照发表的方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示。
2.权利要求1所述的侧翼序列的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取转基因大豆8c-ox-2的基因组DNA，对所述基因组DNA进行基因组重测序，根据重测序结果确定转基因大豆8c-ox-2的T-DNA序列插入到大豆基因组第15号染色体上2779776～2781294碱基之间；
2)提取转基因大豆8c-ox-2的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将所述步骤2)得到的扩增产物进行测序，将得到的测序结果同phytozome数据库中大豆基因组序列和步骤1)得到的T-DNA序列进行序列比对，得到侧翼序列。
3....
【专利技术属性】
技术研发人员：王宁宁，张婵娟，王丹，刘生，单志慧，周新安，
申请(专利权)人：南开大学，中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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