一种定量E.coli细胞残留的核酸检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种定量E.coli细胞残留的核酸检测试剂盒，本发明专利技术可以检测出E.coli细胞DNA的最低浓度为0.1fg/μl，在具有非常好的灵敏度同时还具有很好的特异性，可以用于检测疫苗半成品、成品等样品中E.coli细胞残留DNA；可为疫苗半成品、成品等生产环节提供等提供可靠的质控证据，为疫苗安全生产与使用提供重要保障。

A nucleic acid detection kit for quantitative E.coli cell residues

【技术实现步骤摘要】
一种定量E.coli细胞残留的核酸检测试剂盒
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种定量E.coli细胞残留的核酸检测试剂盒。
技术介绍
E.coli细胞生长快速，可以实现高密度培养用于大规模表达目的产物，因此随着生物工程和制药技术的迅速发展，其被广泛地用于生产重组蛋白、疫苗以及抗癌试剂等新型医用生物制品。此类新型医用生物制品生产中虽然经过严格的纯化工艺，但是产品中仍有残余E.coli细胞的DNA片段。这些痕量DNA直接注射进入身体可能带来传染性或致瘤性风险。由于这类潜在致病风险性，当前国内外行业机构逐渐在许多应用场景对E.coli细胞痕量残留指标制定了相关标准。而经过纯化工艺处理的E.coli细胞DNA属于痕量杂质，在组分背景复杂，产物浓度极高的医用生物制品中对残余的痕量片段化的E.coli细胞DNA进行高特异性、快速高效、准确地定量检测是一项高难度的工作。虽然已经有用染料法实时荧光PCR检测CHO细胞DNA残留的报道，但在疫苗等新型生物制品中残留DNA的检测中，目前还没有针对E.coli细胞DNA残留的，准确性高、重复性精密度高、敏感性高、特异性强、的探针法实时荧光定量PCR检测试剂盒。而临床上检测病原菌感染的核酸检测试剂盒不足以应对新型生物制品的检测要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种定量E.coli细胞残留的核酸检测试剂盒，本试剂盒可用于检测疫苗样品中E.coli细胞残留DNA，从而对疫苗生产过程中进行质量监测。本试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物和一条靶多聚核苷酸的特异性探针，在含有耐热DNA聚合酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg2+的PCR反应缓冲液中，通过荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测靶多核苷酸的目的。本专利技术所提供的检测疫苗样品中E.coli细胞残留DNA的试剂盒包括：(1)分别装有PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量标准品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中，所述PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向引物E.coli-F和反向引物E.coli-R的序列分别是：5’-GCTGAATAGCGAAAGTAACA-3’(SEQIDNO：1)5’-GCATGGAGTATTGCTTCG-3’(SEQIDNO：2)根据本专利技术的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针E.coli-P的序列是：5’-CGCATCAGAAGTGACAACGACT-3’(SEQIDNO：3)。根据本专利技术的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液由(a)耐热DNA聚合酶、(b)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、(c)含镁离子的缓冲液、(d)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，(e)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物，和(f)能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成。根据本专利技术的另一个优选实施方案，其中寡核苷酸探针5’端标记有荧光报告基团，其荧光报告基团为FAM，3’端标记有淬灭基团，其淬灭基团为MGB。根据本专利技术的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为：50oC2min，95oC预变性10min；然后95oC10s，58oC1min，40个循环。根据本专利技术的另一个优选实施方案，其中阴性质控品为HEK293基因组DNA、CHO细胞基因组DNA、Vero细胞基因组DNA。根据本专利技术的另一个优选实施方案，其中阳性质控品为E.coli细胞基因组DNA。根据本专利技术的另一个优选实施方案，其中定量标准品为E.coli细胞基因组DNA，原液浓度为30ng/ul，经稀释的使用浓度，分别为300pg/ul，30pg/ul，3pg/ul，0.3pg/ul，0.03pg/ul。本专利技术的优点和有益效果为：1、本专利技术提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测出E.coli细胞DNA的最低浓度为0.1fg/μl，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。2、本专利技术针对E.coli细胞基因组DNA的基因保守区设计特异引物和探针，可检测出E.coli细胞基因组DNA，但不能检测出非E.coli细胞基因组DNA，说明本试剂盒具有很好的特异性。3、本专利技术提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测疫苗半成品、成品等样品中E.coli细胞残留DNA的试剂盒；可为疫苗半成品、成品等生产环节提供等提供可靠的质控证据，为疫苗安全生产与使用提供重要保障。附图说明图1为本专利技术的E.coli细胞DNA定量标准品的检测结果图；Ct值为18～29，扩增曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳性。图2为定量标准品扩增结果的标准曲线；针对模板数为300pg/ul、30pg/ul、3pg/ul、0.3pg/ul、0.03pg/ul的反应体系进行TaqManPCR分析。细胞基因组DNA为0.03pg/ul时，检测样品的Ct值在34左右，为明显阳性，即检测下限灵敏度可达到0.03pg/ul。绘制得到的标准曲线相关系数(R2)＝0.997。图3定量标准品与其他3种阴性参考品对照的标准曲线，阴性参考品基本呈平直，可明确判定为阴性。3种阴性参考品包括HEK293细胞、Vero细胞和CHO细胞。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的技术方案。实施例1：试剂盒的制备试剂盒的制备包括以下组成成分：E.coli细胞基因组DNA（30ng/ul)(40ul/管)1管、DNA稀释液（7ml/瓶）1瓶、2×qPCR预混液（750ul/管）1管、10×引物探针混合物（150ul/管）1管、超纯水（1.5ml/管）1管。其中，2×qPCR预混液为商业化试剂（天根），DNA稀释液由实验室采用分子生物级试剂自行配置，10×引物探针混合物：将正向引物：反向引物：Taqman探针按照1:1:0.3的比例进行混合，得到10×引物探针混合物。引物和探针由上海生工进行合成纯化，序列如下：正向引物序列:GCTGAATAGCGAAAGTAACA（SeqIDNo:1）反向引物序列：GCATGGAGTATTGCTTCG（SeqIDNo:2）Taqman探针：CGCATCAGAAGTGACAACGACT（SeqIDNo:3）Taqman探针5’端的荧光报告基团为FAM；3’端的淬灭基团为MGB。实施例2E.coli细胞DNA的qPCR测试方法DNA的提取标定：按照基因组DNA提取试剂盒（天根）说明书提取E.coli细胞的基因组DNA，然后利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量E.coli细胞残留的核酸检测试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液由耐热DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、含镁离子的缓冲液、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向引物和反向引物的序列分别为5’-GCTGAATAGCGAAAGTAACA-3’和5’-GCATGGAGTATTGCTTCG-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种定量E.coli细胞残留的核酸检测试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液由耐热DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、含镁离子的缓冲液、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向引物和反向引物的序列分别为5’-GCTGAATAGCGAAAGTAACA-3’和5’-GCATGGAGTATTGCTTCG-3’。


2.根据权利要求1所述的试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：常子嵩，李婷，陈涛，孙明娣，王博玮，李英，
申请(专利权)人：天津欧德莱生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12