蜡样芽孢杆菌的核酸快速恒温检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种针对蜡样芽孢杆菌的快速恒温检测方法、引物组及应用。所述方法为：从待测样品中提取基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，以能扩增蜡样芽孢杆菌特异性序列的引物组为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在蜡样芽孢杆菌。本发明专利技术检测方法具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低，具广泛应用前景。

Rapid and constant temperature detection of nucleic acid of Bacillus cereus and its application

【技术实现步骤摘要】
蜡样芽孢杆菌的核酸快速恒温检测方法及应用本申请是2016年8月30日提交的、申请号为201610767579.3、专利技术名称为：“快速恒温检测蜡样芽孢杆菌的方法、引物及应用”的中国专利技术专利申请的分案申请；该母案申请要求申请日为2015年9月2日、申请号为201510556917.4、专利技术名称为“快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒”的中国专利技术专利申请的优先权。
本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速恒温检测蜡样芽孢杆菌的方法、引物及试剂盒。
技术介绍
蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)广泛分布于自然界中，是一种常见的食源性致病细菌。在临床上，蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒可分为腹泻型和呕吐型两种类型，分别是由该菌产生的腹泻毒素和呕吐毒素所致，前者对热和胰蛋白酶敏感，因而可预防；而后者对热稳定，活性不受胃蛋白酶的干扰，即使微量表达也会对人体有较大危害，不易防范，常引起暴发性食物中毒。因此，对于该菌的预防和检测非常重要。传统蜡样芽孢杆菌检测方法由于检测周期较长，操作相对复杂，检测效率较低，难以满足现代社会对于食源性致病菌检测过程高通量、高灵敏度、高特异性、快速、便捷的要求。近年来随着核酸分子检测技术的发展，研究人员也开发出了PCR等检测手段，但是该方法需要专门的检测仪器，因此，并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。为了确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的蜡样芽孢杆菌。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2组成，BIP由B1C和B2组成)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,YonekawaT,WatanabeK,AminoN,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,NucleicAcidsResearch,2000Jun15；28(12):E63)。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。引物设计是LAMP技术中最为关键的一步，常规做法是将某待检测生物的公认的特异性基因导入LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e)，设定相关参数生成引物组。蜡样芽孢杆菌含有质粒，因此现有技术如专利技术专利CN101831493B和CN101402997B分别是基于质粒或染色体上靶序列进行蜡样芽孢杆菌LAMP引物的设计。然而，由于质粒在拷贝数和遗传结构上存在不稳定性，而现有技术中针对针对蜡样芽孢杆菌染色体上的靶序列设计的LAMP引物也存在引物特异性不够的问题，如本专利技术表1中展示了专利技术专利CN101402997B存在的这一问题。也就是说，现有技术方法中所使用的蜡样芽孢杆菌检测序列实际上并非蜡样芽孢杆菌所特有，即，有可能将非蜡样芽孢杆菌错误地认定为蜡样芽孢杆菌。因此，行业内亟需一种能够确保特异性的蜡样芽孢杆菌检测方法，同时满足基层检测部门对快速、便捷的需求，能够方便地在企业生产线内部开展实时实地检测。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有LAMP技术引物设计中存在的引物通用性和特异性不足的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性识别蜡样芽孢杆菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本专利技术基于GenBank数据库中的微生物基因组数据资源(截至2013年8月5日数据)进行蜡样芽孢杆菌LAMP引物的设计，提供了一种快速恒温扩增检测蜡样芽孢杆菌的方法、引物组及试剂盒。采用本专利技术的检测方法检测蜡样芽孢杆菌，具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。本专利技术提出一种快速检测蜡样芽孢杆菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：(1)从待测样品中提取基因组DNA；(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增蜡样芽孢杆菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物，在酶反应体系下，进行恒温扩增反应；(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在蜡样芽孢杆菌。本专利技术恒温检测蜡样芽孢杆菌菌株的方法，从待测样品中提取基因组DNA，以其为模板，以蜡样芽孢杆菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应，然后，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在蜡样芽孢杆菌。其中，所述酶反应体系包括但不限于DNA聚合酶反应体系。本专利技术中，所述蜡样芽孢杆菌基因组特异性碱基序列为GI号为218895141的蜡样芽孢杆菌的3193434～3194011bp位序列。本专利技术中，所述能扩增蜡样芽孢杆菌基因组特异性碱基序列的引物组为所述基因组(GI号为218895141)的3193434～3194011bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。其中，所述蜡样芽孢杆菌基因组特异性碱基序列是指仅为蜡样芽孢杆菌基因组所特有的，而其它微生物基因组所不包含的碱基序列。其中，所述能扩增蜡样芽孢杆菌基因组特异碱基序列的引物组包括但不限于引物组A，或与该引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为66.7％及以上的引物组。引物组A：上游外引物F3_A：5’-TCCGAAGCACTAGAACAG-3’(SEQIDNO：1)；下游外引物B3_A：5’-TCCTACCGCTTTTGACTC-3’(SEQIDNO：2)；上游内引物FIP_A：5’-CTGGCTGAATTGTTTGTTCGAAAATTGTTGCTTGTGATCCTC-3’(SEQIDNO：3)；下游内引物BIP_A：5’-TATTCAATTGTTGCTTGGTGGCCAATTTCAATTCAGCACCAG-3’(SEQIDNO：4)。本专利技术中，所述能扩增蜡样芽孢杆菌基因组特异碱基序列的引物组还可以包括与前述各引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为66.7％及以上的引物组，该引物组包括但不限于以下引物组B：引物组B：上游外引物F3_B：5’-TCCGAAGCACTAGAACAG-3’(SEQIDNO：5)；下游外引物B3_B：5’-CTTCCATCCTACCGCTTT-3’(SEQIDNO：6)(与引物B3_A5’-TCCTACCGCTTTTGACTC-3’同源性为66.7％)；上游内引物FIP_B：5’-CTGGCTGAATTGTTTGTTCGAAAATTGTTGCTTGTGATCCTC-3’(SEQIDNO：7)；下游内引物BIP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对蜡样芽孢杆菌的快速恒温检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)从待测样品中提取基因组DNA；/n(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增蜡样芽孢杆菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；/n(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在蜡样芽孢杆菌；/n其中，所述蜡样芽孢杆菌基因组特异性碱基序列为GI号为218895141的蜡样芽孢杆菌基因组的3193434～3194011bp位序列；/n其中，所述能扩增蜡样芽孢杆菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物组B；/n引物组B：/n上游外引物F3_B：5’-TCCGAAGCACTAGAACAG-3’(SEQ ID NO：5)；/n下游外引物B3_B：5’-CTTCCATCCTACCGCTTT-3’(SEQ ID NO：6)；/n上游内引物FIP_B：5’-CTGGCTGAATTGTTTGTTCGAAAATTGTTGCTTGTGATCCTC-3’(SEQ IDNO：7)；/n下游内引物BIP_B：5’-TATTCAATTGTTGCTTGGTGGCCAATTTCAATTCAGCACCAG-3’(SEQ IDNO：8)。/n...

【技术特征摘要】
20150902 CN 20151055691741.一种针对蜡样芽孢杆菌的快速恒温检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增蜡样芽孢杆菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；
(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在蜡样芽孢杆菌；
其中，所述蜡样芽孢杆菌基因组特异性碱基序列为GI号为218895141的蜡样芽孢杆菌基因组的3193434～3194011bp位序列；
其中，所述能扩增蜡样芽孢杆菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物组B；
引物组B：
上游外引物F3_B：5’-TCCGAAGCACTAGAACAG-3’(SEQIDNO：5)；
下游外引物B3_B：5’-CTTCCATCCTACCGCTTT-3’(SEQIDNO：6)；
上游内引物FIP_B：5’-CTGGCTGAATTGTTTGTTCGAAAATTGTTGCTTGTGATCCTC-3’(SEQIDNO：7)；
下游内引物BIP_B：5’-TATTCAATTGTTGCTTGGTGGCCAATTTCAATTCAGCACCAG-3’(SEQIDNO：8)。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶反应体系包括：1×BstDNA聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/LMg2+，1.0-1.6mmol/LdNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP_B和BIP_B引物，0.15-0.3μmol/L的F3_B和B3_B引物，0.16-0.64U/μLBstDNA聚合酶，0-1.5mol/L的甜菜碱。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增反应的反应程序为：①60～65℃孵育10～90min；②80℃终止反应2～20min。


4.针对蜡样芽孢杆菌的快速恒温检测的引物，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永梅，李园园，李雪玲，刘伟，韦朝春，贾犇，陆长德，李亦学，
申请(专利权)人：上海旺旺食品集团有限公司，上海产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31