一种分离的生菜LsKN1基因及其在控制生菜结球性状中的应用制造技术

本申请属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种分离的生菜

An isolated lskn1 gene of lettuce and its application in controlling the heading character of lettuce

【技术实现步骤摘要】
一种分离的生菜LsKN1基因及其在控制生菜结球性状中的应用
本专利属于植物工程
具体涉及一种分离的生菜LsKN1基因及其在控制生菜结球性状中的应用。
技术介绍
莴苣属于菊科莴苣属，原产于地中海地区，是重要的蔬菜作物。依据其不同的形态，莴苣可以进一步划分为不同的园艺类型，包括结球莴苣、散叶莴苣、奶油莴苣、罗马莴苣、油用莴苣及莴笋等。叶用莴苣也被统称为生菜。结球生菜是一类非常重要的叶用生菜，其特征表现为叶片向内卷曲、相互包裹，从而形成一个由叶片组成的球状结构。相对于其他生菜，结球生菜具有更好的口感体验，从而备受消费者的青睐。世界范围内，结球生菜的产量占所有生菜总量的一半，因而具有非常重要的经济价值。2017年，生菜基因组测序完成，为生菜不同农艺性状基因的克隆及其功能研究提供了便利。申请人发现，生菜结球是一个由多基因控制且受多种环境因素影响的复杂性状。到目前为止，生菜结球性状的遗传规律以及控制结球性状的基因均未被报道过。因此，对控制生菜结球性状基因的克隆及对其作用机理的解析具有重要的理论和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种分离的生菜LsKN1基因，所述基因为SEQIDNO.1所示，其CDS序列为SEQIDNO.3所示，编码的蛋白质为SEQIDNO.4所示。本专利技术的另一个目的在于提供了生菜LsKN1基因在制备结球生菜中的应用。本专利技术的还有一个目的在于提供了一种增强生菜LsKN1基因表达的转座子，其序列为SEQIDNO.2所示。该序列为一个长度3935bp的CACTA转座子，该转座子在结球基因LsKN1中的插入位置为基因起始密码子后第96个与第97个碱基之间，该转座子可以行使启动子功能，增强LsKN1基因的表达，从而导致结球表型。本专利技术还有一个目的在于提供了上述转座子在制备结球生菜中的应用。本专利技术的最后一个目的在于提供了N端截短的生菜LsKN1蛋白在制备结球生菜中的应用，所述的截短生菜LsKN1蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.6所示。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：生菜结球性状相关基因LsKN1的获得：本专利技术通过利用罗马生菜(Lactucasativavar.longifolia，此类生菜表现为不结球)与结球生菜(Lactucasativavar.capitata，此类生菜表现为结球)进行杂交获得F1代后，进一步自交获得F2代。利用F2代群体，联合BSR-seq和传统遗传定位方法，对控制生菜结球性状基因进行定位。对定位区间进行基因注释及差异表达基因分析，确定了候选基因，成功克隆了控制生菜结球性状的关键基因LsKN1。该基因编码一个含有同源异域结构域的转录因子，属于KNOXI家族。在绝大数植物中，该基因只有一个拷贝，且只在植物的顶端分生组织中表达，对植物顶端分生组织的维持及防止干细胞的过早分化中起着关键的调控作用。进化分析发现，该基因在生菜基因组中发生了一次复制，并且在此基础上，一个长度为3935bp的CACTA转座子插入到该基因的第一个外显子上，从而使该基因的表达模式发生了重大改变并且能够在叶片中大量表达，引起叶片向内弯曲并包裹成叶球。LsKN1与其等位基因的区别就在于第一个外显子中有无CACTA转座子的插入。LsKN1基因序列为SEQIDNO.1所示，插入的转座子序列为SEQIDNO.2所示，CDS序列为SEQIDNO.3所示，编码的蛋白质序列如序列表SEQIDNO.4，编码380个氨基酸。结球基因LsKN1在生菜结球中的应用，利用本领域的常规方式，将LsKN1(SEQIDNO.1所示)在不结球生菜中表达，可以使转基因植株叶片向内弯曲、包裹，并完全恢复结球表型；或者将部分CDS序列(SEQIDNO.5所示，编码的蛋白质为SEQIDNO.6所示)在不结球生菜中超量表达，也可以恢复结球表型，该基因可以用于莴苣属生菜遗传改良及进行新品种培育的应用。更详细的技术方案见《具体实施方式》。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术首次提出了一个控制生菜结球性状的必需基因，该基因作为首个克隆的结球基因，对结球生菜乃至其它结球蔬菜叶球形成机制的解析具有重要的理论意义。此外，到目前为止，LsKN1基因也从未报道过参与任何植物的结球表型。该基因可以为菊科莴苣属叶用莴苣提供新的基因资源，有利于培育出新的生菜品种。附图说明图1：结球基因LsKN1可以互补生菜的结球表型。其中：(a)不结球生菜NHG，LsKN1com#1及LsKN1com#2为LsKN1转基因互补植株，转基因受体材料为不结球生菜NHG。红色箭头代表叶球。标尺为5cm。(b)转基因植株LsKN1com#1T1代单株基因型与表型分析。H代表结球表型；N代表不结球表型。扩增出条带的孔道代表含有LsKN1转基因插入的植株；无扩增条带的孔道代表无LsKN1转基因插入的植株。图2：过表达LsKN1基因产生生菜结球表型。其中：NHG为不结球生菜，用于LsKN1过表达的受体。LsKN1OE#1,LsKN1OE#2及LsKN1OE#3为LsKN1基因的过表达植株。红色箭头代表叶球，标尺为5cm。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：生菜结球基因LsKN1的获得：1.生菜结球表型的遗传分析为分析生菜结球性状的遗传规律，本专利技术采用结球生菜(表型为结球)与罗马生菜(表型为不结球)进行杂交获得F1，进一步自交，获得F2代群体。对F2代个体进行结球表型评估、记录及统计分析，发现F2群体中结球表型表现为连续分布的数量遗传性状，暗示生菜的结球表型为由多基因控制的复杂性状。2.LsKN1基因的图位克隆为克隆上述群体中控制生菜结球性状的关键基因，本研究采用了BSR-seq的分析方法。从F2群体中选取结球单株20株和完全不结球单株20株，取相同生长部位及大小的叶片混合后磨样，提取两个混池的总RNA，并进一步采用Illumina对RNA进行测序。将RNA测序数据比对到生菜参考基因组上，采用SAMtools对两个混池进行SNP分析，并计算Δ(SNP-index)平均值，采用perl脚本对Δ(SNP-index)平均值进行图形展示。结果表明，在生菜七号染色体的前端有一个峰，即此位置存在一个对结球性状具有贡献的遗传位点。借助分子标记，我们筛选到一个由该位点控制且结球表型符合孟德尔单基因分离规律的F2:3亚群体，并且将LsKN1基因初步定位于YHP003(5.87Mb)至YHP040(33.39Mb)之间。进一步扩大上述群体的种植和分子标记的开发，最终我们将LsKN1基因定位于YHP049(18.54Mb)至YHP053(18.99Mb)之间约500Kb的范围内。对该区间序列进行注释分析发现，该区间共编码11个基因，其中基因LG7600774在两个混池中存在显著的差异表达，因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的结球生菜的基因，所述基因为SEQ ID NO.1所示/n权利要求1所述的基因在制备结球生菜中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的结球生菜的基因，所述基因为SEQIDNO.1所示
权利要求1所述的基因在制备结球生菜中的应用。


2.一种分离的结球生菜的转座子序列，其序列为SEQIDNO.2所示。


3.其CDS序列为SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡汉晖，余长春，严承欢，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42