米根霉CH5及其在提取紫芝多糖中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种米根霉CH5及其在提取紫芝多糖中的应用，所述应用的方法为：将米根霉CH5孢子接种于含无菌水的紫芝粉中，于28–30℃发酵2–3d，发酵物烘干后，获得发酵紫芝粉；发酵紫芝粉经脱色获得脱色紫芝粉；脱色紫芝粉经水提、浓缩，获得浓缩液；浓缩液经醇沉和真空干燥后，获得紫芝粗多糖。米根霉CH5是从紫芝的微生物富集培养物中分离，经过筛选获得的优良菌株，在紫芝粉中适度生长产生多糖水解酶，对紫芝不溶性多糖结构组织的水解，促进结合态可溶性多糖的解离，从而显著提高了紫芝多糖的提取收率。在优选工艺条件下，紫芝多糖的提取得率为5.92％，较未发酵提取法提高了35％以上。

Rhizopus oryzae CH5 and its application in the extraction of Polysaccharide from Ganoderma

【技术实现步骤摘要】
米根霉CH5及其在提取紫芝多糖中的应用(一)
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种采用微生物发酵法提高紫芝多糖提取收率的方法。(二)
技术介绍
紫芝(Ganodermasinense)别名黑芝、玄芝，又称“中国灵芝”、“仙草”，为担子菌类多孔菌科灵芝属真菌。紫芝是我国名贵中药灵芝的一种，《本草纲目》中记载：紫芝一名木芝，气味甘、温、无毒；主治耳聋，利关节，保神，益精气，坚筋骨，好颜色，久服，轻身不老延年。2015版中国药典一部收载的灵芝，紫芝属灵芝中的一种，性味甘、平，归心、肺、肝、肾经。具补气安神、止咳平喘功能，主治。心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食。现代科学证明，紫芝有广泛的药理作用和多种保健价值，目前从紫芝中分离出来的成分超过150种，其主要的生理活性物质为多糖类、三萜类、油脂类、蛋白类、生物碱类和甾醇类等，其中，尤为关注的是多糖，其具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗衰老及降血糖降血脂等功效，因此紫芝多糖类产品备受人们青睐。目前，市场已有紫芝多糖片销售，具有滋补强壮，养心安神的功效，用于神经衰弱，白细胞和血小板减少症，电离辐射及职业性造血损伤及肿瘤患者放疗或化疗后白细胞下降等症。目前，紫芝多糖主要是紫芝子实体提取，人们对紫芝多糖的提取技术进行较多探究，目前有热水浸提法、超声波法和超临界法等提取法。虽然有些先进的技术大大提高了多糖的得率，但是有些方法会使多糖结构被破坏，其生理活性被降低。为了进一步提高紫芝多糖的提取收率，本专利技术对传统热水浸提多糖的工艺进行改进，增加微生物发酵预处理，从而提高了紫芝多糖的提取收率。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株新的微生物菌株—米根霉(Rhizopusoryzae)CH5，及其在紫芝多糖提取中的应用，能够显著提高紫芝多糖提取的收率。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株—米根霉(Rhizopusoryzae)CH5，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60990，保藏日期2020年3月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。本专利技术所述米根霉CH5，是从紫芝的微生物富集培养物中分离，经过筛选得到的优良菌株。所述米根霉CH5的形态特征如下：在马铃薯琼脂平板培养基上，28℃条件下培养，菌落初期为白色细绒毛状，1天后逐渐变为灰褐色；假根发达，呈褐色；孢囊梗由生假根处的匍匐菌丝生出，直立或稍弯曲，3–5枝丛生；孢子囊球形或椭圆形，深褐色，分生孢子多数为椭圆形，直径7.0–10.0μm，呈褐色。米根霉CH5菌株在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见附图1。米根霉CH5的rDNA核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供一种所述米根霉CH5在紫芝多糖提取中的应用，所述应用的方法为：将米根霉CH5孢子接种于含无菌水的紫芝粉中，于28–30℃发酵2–3d，发酵物烘干(优选85℃)后，获得发酵紫芝粉；发酵紫芝粉经脱色获得脱色紫芝粉；脱色紫芝粉经水提、浓缩，获得浓缩液；浓缩液经醇沉和真空干燥后，获得紫芝粗多糖。进一步，所述无菌水体积加入量以紫芝粉重量计为1.5–2.0mL/g，所述紫芝粉是将紫芝粉碎后过40目筛获得。进一步，所述米根霉CH5孢子接种量以紫芝粉重量计为3–5×107个/g。进一步，所述米根霉CH5孢子以孢子液的形式加入，所述孢子液的制备方法为：低温保藏的米根霉CH5接种于PDA平板培养基，于28–30℃恒温培养2–3d后，加入无菌水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为3–5×108个/mL。所述的PDA平板培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/L(煮沸30min后过滤留汁)，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)。进一步，所述的脱色方法为：向发酵紫芝粉中加入丙酮，50℃、100r/min振荡脱色1–2次(优选每次2h)，脱色后的紫芝粉于50℃下干燥至恒重，获得脱色紫芝粉；所述丙酮体积用量以发酵前紫芝粉重量计为5–10mL/g。进一步，所述浓缩液的制备方法为：向脱色紫芝粉中加入去离子水，搅拌均匀后置于90–95℃恒温水浴锅中浸提2–4h，趁热过滤，将滤液65℃减压浓缩至原体积的1/4–1/5，获得浓缩液；所述去离子水体积用量以发酵前紫芝粉重量计为15–20mL/g。进一步，所述浓缩液经醇沉和真空干燥的方法为：向浓缩液中加入3–4倍体积的95％乙醇，室温静置沉淀10–15h后，布氏漏斗抽滤，收集多糖沉淀，于60℃真空干燥至恒重，获得紫芝粗多糖。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：在紫芝多糖脱色水提前，增加了米根霉CH5的发酵预处理。米根霉CH5是从紫芝的微生物富集培养物中分离，经过筛选获得的优良菌株，在紫芝粉中适度生长产生多糖水解酶，对紫芝不溶性多糖结构组织的水解，促进结合态可溶性多糖的解离，从而显著提高了紫芝多糖的提取收率。在优选工艺条件下，紫芝多糖的提取得率为5.92％，较未发酵提取法提高了35％以上。(四)附图说明图1米根霉CH5的菌落形态图。图2苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：本专利技术实施例所述的紫芝为真菌紫芝(Ganodermasinense)的子实体，其生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、多孔菌目(Polyprales)、灵芝科(Ganodermataceae)、灵芝属(Ganoderma)。本专利技术所述室温是指25–30℃。实施例1发酵菌株的分离、筛选和鉴定1、菌株CH5分离与筛选(1)250-mL三角瓶中加入20g经粉碎过40目筛的紫芝粉，再加入30mL无菌水润湿，于28℃恒温培养4d。将长满霉菌的富集培养物用无菌水稀释1×106倍后涂布于PDA平板培养基上，于28℃恒温培养3d，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA培养基，置于28℃恒温培养3d，得纯培养菌株7株，分别予以编号CH1–CH7。7个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入5mL无菌水，用接种环搅拌使得孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌水调整孢子浓度为3×108个/mL。所述的平板培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入蔗糖20g、琼脂20g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后倒入直径9cm的无菌培养皿，冷却后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.米根霉(Rhizopus oryzae)CH5，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60990，保藏日期2020年3月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。/n

【技术特征摘要】
1.米根霉(Rhizopusoryzae)CH5，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60990，保藏日期2020年3月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。


2.一种权利要求1所述米根霉CH5在紫芝多糖提取中的应用。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将米根霉CH5孢子接种于含无菌水的紫芝粉中，于28–30℃发酵2–3d，发酵物烘干后，获得发酵紫芝粉；发酵紫芝粉经脱色获得脱色紫芝粉；脱色紫芝粉经水提、浓缩，获得浓缩液；浓缩液经醇沉和真空干燥后，获得紫芝粗多糖。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无菌水体积加入量以紫芝粉重量计为1.5–2.5mL/g。


5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述米根霉CH5孢子接种量为3–5×107个/g。


6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的米根霉CH5以米根霉CH5孢子液的形式接种，所述米根霉CH5孢子液按如下方法制备：将米根霉CH5接种于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈虹，张建芬，雷超，谢广发，
申请(专利权)人：浙江树人学院浙江树人大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33