一种用于细胞骨架标记的荧光探针制造技术

本发明专利技术提供了一种用于细胞骨架标记的荧光探针，该荧光探针化学结构特征如下：荧光团母体是萘酰亚胺类染料，其一端连接琥珀酰亚胺活性基团用于标记抗体，该荧光探针的具体结构如式(1)所示。该探针与其他常用的探针如罗丹明、荧光素、BODIPY相比光稳定性好，更适合于超分辨显微镜的成像，将该探针标记到细胞骨架对应的抗体上，能够标记细胞骨架并清晰成像。

A fluorescent probe for cytoskeleton labeling

【技术实现步骤摘要】
一种用于细胞骨架标记的荧光探针
本专利技术属于生物分析检测领域，具体涉及一种用于细胞骨架标记的荧光探针。
技术介绍
细胞作为生物体生命活动的基本单位，是生物学领域关注的重点对象。通过显微成像技术观察细胞内部的组分，以期获得对亚细胞结构功能更完整的认知是几十年来科学家不断深入挖掘的科研问题。传统的光学显微镜成像因受到光波衍射效应的限制，已达到分辨率的极限，无法对细胞内纳米级别的细胞器及细胞组分进行观测与研究。近些年随着新型荧光分子的出现及数字显影等技术的改革与创新，激光扫描共聚焦荧光成像技术应运而生。该技术无需对细胞进行固定和灭活，通过激光对荧光标记细胞的不同切面进行逐层连续扫描，并将所得光切片通过计算机重构三维立体模型，能够实时精准定位活细胞内的组分的三维空间排布，大大提高显微成像分辨率，因此被广泛应用于探究细胞内各种生命活动的规律。而细胞内直径介于10-20纳米之间的细胞骨架，作为细胞内最晚被发现的细胞器，因其直径无法用常规光学显微镜观测，借助激光扫描共聚焦荧光成像的平台，近年来科学家对细胞骨架的结构与功能理解又提升了新的层次。细胞骨架是指真核细胞的细胞核及细胞膜内侧面由微丝、微管及中间纤维等蛋白组成的复杂网络体系，其主要作用在于对真核细胞正常形态结构进行机械支撑、保护细胞器免受细胞外力损伤等。近年来结合共聚焦荧光成像的研究证据表明，细胞骨架还参与调控了细胞内多项重要的生命活动，如细胞有丝分裂时牵引染色体、为细胞内物质运输和信号转导提供定向轨道、参与细胞凋亡、协助免疫应答细胞在机体内运动迁移以及与肿瘤细胞的组织侵袭与转移有关。目前我们对细胞骨架的功能还不具备完整的认知，因此值得借助更高分辨率的成像手段对其进一步探索。现阶段实现动态观察细胞骨架的方法主要是通过特定的荧光染料对微丝微管蛋白进行标记，使用不同波长的激发光，处理光线使之聚焦于细胞某一焦平面上，位于该照射点的染料受到激发而发射相应波长荧光，随后光信号被计算机接收解析并反馈，从而实现荧光在细胞骨架的定位成像。为了达到荧光成像的最佳信噪比和更高分辨率，提高激发光的强度成为了首要选择。然而传统的荧光染料受光漂白效应的影响，在共聚焦系统中接受高强度激发光的连续扫描，光吸收趋于饱和状态，荧光团中激发态的分子被不可逆破坏，使荧光信号随照射时间大幅度衰减，严重影响了细胞骨架的定位成像。由此，目前亟待于研发一种新型的光稳定的荧光分子探针靶向细胞骨架，减少激光共聚焦成像时荧光分子产生的光漂白作用，提高细胞骨架激光扫描共聚焦成像的高信噪比、高分辨率，以实现连续动态探究细胞骨架的更多生理学功能。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于细胞骨架标记的荧光探针；，该探针的稳定性要强于传统的罗丹明、荧光素、BODIPY等染料，用其标记细胞骨架蛋白在共聚焦显微镜或者超分辨显微镜下成像得到清晰的结构。本专利技术一种用于细胞骨架标记的荧光探针，该探针分子结构式如下：一种用于细胞骨架标记的荧光探针的合成方法，其合成步骤如下：(1)中间体BCOMe-NBr的合成：将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，4-氨基丁酸乙酯盐酸盐，三乙胺溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚或体积比为1:0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体BCOMe-NBr；(2)探针BCOOH-DAC的合成：将BCOMe-NBr，溶于乙二醇甲醚中，向其中加入环己二胺。将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体BCOMe-DAC；BCOMe-DAC甲醇中，并向反应液中滴加2M氢氧化钠溶液。室温下反应1-3h后，减压蒸馏除去甲醇，过滤并用水洗涤滤饼干燥后得BCOOH-DAC；(3)带有NHS活性基团的荧光染料合成将BCOOH-DAC，DCC溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，室温搅拌10-40min。N-羟基琥珀酰亚胺溶于1mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺并加入反应液中。2-5h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比4～20:1的二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂，除去溶剂后得NHS活性基团的荧光染料NHSB-DAC；步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、4-氨基丁酸乙酯盐酸盐、三乙胺的质量比为1:1-3:1-3；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL；步骤(2)中，其中，BCOMe-NBr与环己二胺的质量比为1:1-3；BCOMe-NBr的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-50:1g/mL；BCOMe-DAC的质量与甲醇的体积比为10-20:1g/mL；；BCOMe-DAC的质量与2M氢氧化钠溶液的体积比为10-20:1g/mL；；BCOMe-DAC的质量与水的体积比为10-20:1g/mL；步骤(3)中，BCOOH-DAC、DCC、NHS质量比为1:1-5:1-10；BCOOH-DAC的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-20:1(g：mL)。所述的一种用于细胞骨架标记的荧光探针，其特征在于该探针用于细胞骨架的标记，标记方法如下：(1)细胞骨架蛋白对应的单克隆抗体标记细胞；(2)将荧光探针标记到对应的多克隆抗体；(3)荧光标记的多克隆抗体标记单克隆抗体，进而标记对应的细胞骨架蛋白。所述的荧光探针标记细胞骨架的方法，其特征在于：该方法标记的细胞骨架为微管、微丝、中间纤维。所述的荧光探针标记细胞骨架的方法，其特征在于：该方法标记的细胞骨架可用于共聚焦显微镜或者超分辨显微镜成像。本专利技术的优点和有益效果为：该探针的稳定性要强于传统的罗丹明、荧光素、BODIPY等染料，用其标记细胞骨架蛋白在共聚焦显微镜或者超分辨显微镜下成像得到清晰的结构图像附图说明图1实施例3制备的荧光探针NHSB-DAC核磁谱图氢谱；图2实施例3制备的荧光探针NHSB-DAC的高分辨质谱；图3为实施例4中描述的由实施例3制备的荧光探针NHSB-DAC的光稳定性检测图谱。图4为实施例5中描述的实施例3制备的荧光探针NHSB-DAC标记多克隆抗体羊抗小鼠IgG之后的SDS-PAGE电泳图。图5为实施例6中描述的实施例5制备的NHSB-DAC标记的多克隆抗体羊抗小鼠IgG标记微丝蛋白的荧光共聚焦成像。图6为实施例7中描述的实施例5制备的NHSB-DAC标记的多克隆抗体羊抗小鼠IgG标记微管蛋白的荧光共聚焦成像。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1中间体6-(N-(4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺))氨基丁酸乙酯(BCOMe-NBr)的合成4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于细胞骨架标记的荧光探针，其特征在于该探针分子结构式如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞骨架标记的荧光探针，其特征在于该探针分子结构式如下：





2.根据权利要求1所述一种用于细胞骨架标记的荧光探针的合成方法，其特征在于合成步骤如下：
(1)中间体BCOMe-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，4-氨基丁酸乙酯盐酸盐，三乙胺溶于无水乙醇中，将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h，将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚，或体积比为：0～0.01的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体BCOMe-NBr；
(2)探针BCOOH-DAC的合成：
将BCOMe-NBr溶于乙二醇甲醚中，向其中加入环己二胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为50～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体BCOMe-DAC；
将BCOMe-DAC溶于甲醇中，并向反应液中滴加2M氢氧化钠溶液。室温下反应1-3h后，减压蒸馏除去甲醇，过滤并用水洗涤滤饼干燥后得BCOOH-DAC；
(3)带有NHS活性基团的荧光染料合成
将BCOOH-DAC，DCC溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，室温搅拌10-40min；N-羟基琥珀酰亚胺溶于1mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺并加入反应液中；2-5h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比4～20:1的二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂，除去溶剂后得NHS活性基团的荧光染料NHSB-DAC。


3.根据权利要求1所述的一种用于细胞骨架标记的荧光探针的合成方法，其特征在于步骤(1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，苗露，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21