一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用技术

本发明专利技术属于医用仿生材料技术领域，特别涉及一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用，该制备方法包括如下步骤：S1，材料准备，包括制备蛋壳膜、制备酶解液和制备蛋白矿化液三部分，所述酶解液通过将蛋白酶和还原剂溶解于去离子水中，调节pH至6～9制备得到，所述蛋白矿化液中通过将水溶性蛋白溶解于矿化液中制备得到；S2、制备仿生矿化膜，将所述内层蛋壳膜和/或外层蛋壳膜浸泡于酶解液中，得到改性蛋壳膜；将所述改性蛋壳膜置于蛋白矿化液中处理得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜，可用作骨组织修复材料，制备过程具有矿化效率高、制备周期时间短、矿化效果好的特点。

A biomimetic mineralized membrane based on layered eggshell membrane and protein induction, its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用
本专利技术属于医用仿生材料
，特别涉及一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜、制备方法及应用。
技术介绍
骨缺损一般由遗传疾病、交通事故、病理性骨折、感染等原因引起，骨缺损的修复问题是临床医学实践中的常见问题，每年数以万计的骨损伤患者需要治疗。通常，骨缺损的治疗，包括使用自体或同种异体的骨移植物来完成。但是，自体骨移植会在供体部位引起疼痛和并发症，并且其大小和形状不易控制；异体骨移植物的来源有限，愈合能力无法预测，并且成骨能力低，无法满足实际需求。寻找具有良好生物相容性、可促进骨修复的材料近来受到了广泛的关注。与骨膜的结构类似，蛋壳膜由外层膜、内层膜和限制膜三层膜组成，成分中含有大于80％的蛋白质、约3％的脂质体和约2％的糖，蛋壳膜独特的成分构造，保证了其具有良好的生物相容性。蛋壳膜中的胶原蛋白，主要包括I型、V型和X型，其中，外层蛋壳膜中主要分布I型胶原蛋白，而内层蛋壳膜中主要分布为I型和V型胶原蛋白。仿生矿化是在底物表面上沉积羟基磷灰石涂层的一种自矿化行为，如今，已经成功地在不同材料表面上进行羟基磷灰石涂层矿化。其中，以胶原蛋白作为骨组织中的有机质经被常用于作为仿生矿化的模板，天然胶原纤维的结构在提取和重建过程中，难以维持其原本结构，且机械性能较差；一些合成聚合物，如L-乳酸、聚乳酸-乙醇酸和碳纳米管电纺纤维等，也可以被用于仿生矿化模板，虽然弥补了天然胶原纤维机械性能差的缺陷，合成过程复杂，且，具有疏水性表面、缺乏生物活性基团等特性，不仅削弱了其矿化能力，还表现出较差的生物相容性；蛋壳膜纤维由富含胶原蛋白的核，与富含糖蛋白的外壳组成。虽然，已有报道，可以用天然蛋壳膜作为模板，用来构建蛋壳膜/羟基磷灰石复合材料，但存制备周期长、矿化效果慢等缺点，制备工艺还需要进一步提高。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述问题，提供一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜，以及其制备方法，该制备方法具有矿化效率高、制备周期时间短、矿化效果好的特点，以及在骨组织修复中的应用。本专利技术采用以下技术方案来实现：一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，包括如下步骤，S1，材料准备，包括制备制备蛋壳膜，制备酶解液和制备蛋白矿化液三部分；制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从气室部位分离得到内层蛋壳膜后，剩余部分浸泡于弱酸溶液中处理，得到外层蛋壳膜，将获得的内层蛋壳膜和外层蛋壳膜分别用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；通过弱酸分离获得的内层蛋壳膜，具有均一、致密的纤维网络结构，且纤维中的胶原核心占比较大；优选的，所述弱酸溶液为乙酸的水溶液、柠檬酸的水溶液或苹果酸的水溶液，所述弱酸溶液的浓度为2～22％(v/v)，浸泡于弱酸溶液中处理时间为10～50min；本专利技术中，所述鲜蛋是指鸡、鸭、鹌鹑、鹅或鸵鸟等鸟类、禽类产生的蛋类，产蛋时间不超过60天；制备酶解液，将蛋白酶和还原剂溶解于去离子水中，调节pH至6～9，得到酶解液；优选的，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、角蛋白酶或胃蛋白酶；优选的，所述还原剂为亚硫酸钠、硫化钠或L-半胱氨酸；制备蛋白矿化液，将水溶性蛋白溶解于矿化液中，得到蛋白矿化液；优选的，所述水溶性蛋白优选为卵黄高磷蛋白，浓度为0.1-0.5g/L，即每0.1-0.5g的卵黄高磷蛋白溶解于1L的矿化液中，得到蛋白矿化液；所述矿化液优选为1倍模拟体液、1.5倍模拟体液或10倍模拟体液；所述1倍模拟体液购自上海源叶生物科技有限公司，货号为R24030；所述1.5倍模拟体液购自上海源叶生物科技有限公司，货号为R24029；所述10倍模拟体液配置方法为：将58.43g/LNaCl、0.373g/LKCl、3.675g/LCaCl2·2H2O、1.016g/LMgCl2·6H2O和1.420g/LNa2HPO4，按顺序溶解于800mL去离子水中，用0.1M盐酸调节pH至4.3～4.35，然后加去离子水定容至1L，使用时加入0.84g/LNa2HCO3获得10倍模拟体液；S2、制备仿生矿化膜：将所述内层蛋壳膜膜和/或外层蛋壳膜浸泡于酶解液中，在30～70℃条件下处理5～50min后，得到改性蛋壳膜；将所述改性蛋壳膜置于蛋白矿化液中混合，在35～39℃且优选为37℃恒温条件下，搅拌反应得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜；优选的，每1g改性蛋壳膜，与100～400mL蛋白矿化液混合；优选的，所述搅拌反应在恒温震荡箱中进行，搅拌速度为20～200rpm，反应时间为10～18h。一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜，采用上述任意方法制备而成。一种上述基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜在骨组织修复中的应用。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术通过对鲜蛋的处理，分离得到内层蛋壳膜和外层蛋壳膜，外层蛋壳膜纤维网络结构不规律，且纤维间隙较大；内层蛋壳膜具有均一、致密的纤维网络结构，且纤维中的胶原核心占比较大，有利于成骨细胞的黏附和增殖，内层蛋壳膜和外层蛋壳膜通过酶解液和蛋白矿化液处理后，在促进成骨细胞(MC3T3-E1)增殖和分化方面具有较好潜力，可应用于骨组织的修复。2、本专利技术采用酶解液对内层蛋壳膜和/或外层蛋壳膜进行处理得到改性蛋壳膜，改性蛋壳膜可快速、高效地进行矿化，酶解液能够在短时间内最大程度地暴露壳膜纤维内部的活性物质，对蛋壳膜纤维表面矿化的同时，实现了壳膜纤维外壳结构中矿物生成的效果，有效提高了内层蛋壳膜和/或外层蛋壳膜的矿化潜质，即能够提高矿化效率、减少了矿化时间。3、本专利技术利用卵黄高磷蛋白对改性蛋壳膜进行诱导矿化，其高度磷酸化基团，能够促进壳膜纤维表面和内部晶型的转变，促进矿物生成，引导小尺寸晶体均匀生成，且实现纤维内部的全矿化，极大地程度地缩短了有效矿化物的生成时间，并且，卵黄高磷蛋白具有生物兼容性、无毒性等优点，可以替代合成的化工材料，避免了毒性危害，具有良好的生物安全性。4、采用本专利技术方法制备的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜，实现了壳膜纤维的内部矿化；基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜中的蛋白质/羟基磷灰石复合物很好的模拟了人体内的骨环境，具有良好的生物兼容性，能够促进成骨细胞(MC3T3-E1)的增殖、ALP活性以及胶原蛋白分泌，有利于骨再生，可用做骨组织的修复材料。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是实施例3、实施例4、实施例6、对比例2和对比例3中基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜的微观形貌图。图2是实施例3、实施例4、对比例1、对比例2和对比例3中基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜的表面晶型分析图。...

【技术保护点】
1.一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，包括如下步骤，/nS1，材料准备：/n制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从气室部位分离得到内层蛋壳膜后，剩余部分浸泡于弱酸溶液中处理，得到外层蛋壳膜，将获得的内层蛋壳膜和外层蛋壳膜分别用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；/n制备酶解液，将蛋白酶和还原剂溶解于去离子水中，调节pH至6～9，得到酶解液；/n制备蛋白矿化液，将水溶性蛋白溶解于矿化液中，得到蛋白矿化液；/nS2、制备仿生矿化膜：/n将所述内层蛋壳膜和/或外层蛋壳膜浸泡于酶解液中，在30～70℃条件下处理5～50min后，得到改性蛋壳膜；将所述改性蛋壳膜置于蛋白矿化液中混合，在35～39℃恒温条件下，搅拌反应得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1，材料准备：
制备蛋壳膜，将鲜蛋去除蛋清和蛋黄后，从气室部位分离得到内层蛋壳膜后，剩余部分浸泡于弱酸溶液中处理，得到外层蛋壳膜，将获得的内层蛋壳膜和外层蛋壳膜分别用去离子水清洗干净，裁剪至合适大小后，烘干备用；
制备酶解液，将蛋白酶和还原剂溶解于去离子水中，调节pH至6～9，得到酶解液；
制备蛋白矿化液，将水溶性蛋白溶解于矿化液中，得到蛋白矿化液；
S2、制备仿生矿化膜：
将所述内层蛋壳膜和/或外层蛋壳膜浸泡于酶解液中，在30～70℃条件下处理5～50min后，得到改性蛋壳膜；将所述改性蛋壳膜置于蛋白矿化液中混合，在35～39℃恒温条件下，搅拌反应得到基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备的仿生矿化膜。


2.根据权利要求1所述的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，步骤S1中，所述弱酸溶液为乙酸的水溶液、柠檬酸的水溶液或苹果酸的水溶液，所述弱酸溶液的浓度为2～22％(v/v)，浸泡于弱酸溶液中处理时间为10～50min。


3.根据权利要求1所述的基于分层蛋壳膜和蛋白诱导制备仿生矿化膜的方法，其特征在于，步骤S1中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、角蛋白酶或胃蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄茜，赵前程，马美湖，金永国，付星，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42