一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术属于医药生物技术领域，具体公开了一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒，该试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38组成。进一步地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、显色液、终止液和洗涤液。本发明专利技术的ELISA试剂盒可以有效检测食管鳞癌，尤其是早期食管鳞癌，其检测灵敏度高达92.7%，特异度高达84.0%，可用于食管鳞癌高发区无症状人群的大规模筛查、诊断，有利于无症状高危人群筛查和早期发现。

An ELISA kit for early diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma

【技术实现步骤摘要】
一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒
本专利技术属于医药生物
，具体涉及一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒。
技术介绍
食管鳞癌(Esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)是发生于人食管上皮组织的一种恶性肿瘤，它降低人们的生活质量，严重危及人们是生命健康，给患者家庭带来沉重的灾难，给国家带来沉重的负担。ESCC是全球范围内常见的消化系统恶性肿瘤，世界各国均存在典型的食管鳞癌高发区。中国的食管鳞癌高发区域聚集特性突出，70年代以来陆续发现许多典型食管鳞癌高发区，如河南林县、河北磁县、山东肥城、山西阳泉等，而食管鳞癌正是该地区肿瘤相关死亡的主要原因。现有研究已经发现了几个与ESCC发生发展相关的风险因素，包括生活方式(吸烟、饮酒、吃热烫食物、常吃腌制食物、蛋白质或维生素摄入量低、吃霉变食物)和疾病状况(肥胖、胃肠道炎症、胃食管返流、幽门螺杆菌感染)等。由于缺乏特异度强、敏感度高、经济简便的早期诊断食管鳞癌和高危人群筛查指标和方法，导致初次就诊的病人中，80％都是中晚期患者，预后极差，5年生存率仅为10％左右。肿瘤细胞的分化程度、淋巴结转移等被认为是影响食管鳞癌患者术后生存期的主要因素。肿瘤细胞的浸润侵袭和恶性转移则是导致食管鳞癌复发和死亡的主要原因。目前对食管鳞癌早期筛查最常见的方法是胃镜检查。但是，因内镜筛查有创伤、高成本和低效率(例如，常规高发区内镜筛查如上“高危人群”，早期癌的发现率仅2％左右，约90％以上的无症状“高危人群”均为“陪伴检查”)，限制了内镜筛查在无症状高危人群食管鳞癌早期发现中的推广应用。因此，筛选高效、特异的食管鳞癌分子标志物对于食管鳞癌患者的早期发现、早期筛查不仅有助于提高食管鳞癌生存期，而且可以为食管鳞癌生物防治提供新的思路。这是目前所要解决的首要问题。肿瘤相关抗原(Tumor-associatedAntigen，TAA)是与病理生理过程相关的可测量的变化。近年的研究发现了一系列恶性肿瘤的相关抗原，其中一些已经应用于临床辅助诊断，比如当甲胎蛋白已作为肝癌诊断的一项生物学指标、CA125已应用于卵巢癌的普查和筛选，癌胚抗原(CEA)已作为早期诊断肠道腺癌特异度标志物。本研究团队在前期利用全基因组关联分析、全基因组测序和全基因组外显子测序等技术建立的基因组学数据库的基础上，应用自身抗体芯片技术筛选出6种TAA，分别为HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38，并且发现在食管粘膜鳞状上皮发生癌变之前就能够检测到上述6种TAA的自身抗体存在，这些自身抗体对于食管鳞癌和癌前病变患者具有较高的特异度和敏感性。因此，本研究用这6种TAA制成的试剂盒能够应用于高发区无症状人群早期食管鳞癌筛查并预测其转归。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题和不足，本专利技术旨在提供一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒。为实现专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：肿瘤相关抗原HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38的组合在制备用于食管鳞癌诊断的试剂盒中的应用。一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38组成。根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。更加优选地，所述样品稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，所述显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；所述终止液为10％的硫酸；洗涤液为含0.05％吐温20的pH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液。根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体带有可检测的标记物。根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述标记物为辣根过氧化物酶。根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述第二抗体为RecA蛋白。根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述阳性对照血清为CD38阳性对照血清，所述阴性对照血清为CD38阴性对照血清。根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述CD38阳性对照血清是使用间接ELISA和Westernblot方法检测CD38抗体均为阳性的食管鳞癌患者血清，所述CD38阴性对照血清是使用间接ELISA和Westernblot方法检测PCNA抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。大量研究已明确表明CD38抗原在食管鳞癌的发生发展过程中起十分重要的调节作用，并且抗CD38抗体在食管鳞癌患者血清中具有较高的阳性率。本专利技术选择CD38抗体阳性血清作为阳性对照，同一ELISA试剂盒的其他抗原抗体反应的强弱可以据此作为参照，达到质控的目的。根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述固相载体为酶标板。更加优选地，所述固相载体优选为为48孔酶标板(共6行8列)；所述48孔酶标板按照精心设计的布局图(参见图1)包被HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38这6种肿瘤相关抗原，其中每行包被有一种抗原，每种抗原包被于7个点样孔中。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入本专利技术ELISA试剂盒的48孔酶标板的一列，可达到同时检测出该血清样品中6种抗TAA抗体表达水平的目的。所述48孔酶标板上设有空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔，所述空白对照孔中包被不含抗原的包被液，所述阳性对照孔和阴性对照孔中均包被CD38抗原。根据上述的ELISA试剂盒，优选地，所述试剂盒的检测对象为人类血清。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入本专利技术ELISA试剂盒的48孔酶标板的一列，可达到同时检测出该血清样品中6种抗TAA抗体表达水平。本专利技术中六种肿瘤相关抗原的基本信息如下：高迁移率族蛋白(HMGB1)是一种非组蛋白染色体结合蛋白，主要存在于细胞核中，其在从活化的巨噬细胞、单核细胞、树突细胞或如NK细胞等其他细胞主动分泌时充当蛋白促炎性细胞因子，HMGB1充当炎症触发物从而吸引炎性细胞，并充当组织修复触发物从而募集干细胞并促进其增殖。而且，HMGB1使树突细胞(DC)活化并促进其功能性成熟以及其对淋巴结趋化因子的响应。当外界环境发生改变时，HMGB1可以主动或被动释放至细胞外，引起下游信号通路的激活，促使肿瘤细胞发生转移、浸润。因此HMGB1可以作为食管鳞癌早期筛查的新靶点。Toll样受体(Toll-likereceptor，TLR)，主要有TLR2、TLR4和TLR9。HMGBl与TLR结合后，主要通过髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactors88，MyD88)依赖信号通路转导，激活核因子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肿瘤相关抗原HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38的组合在制备用于食管鳞癌诊断的试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.肿瘤相关抗原HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38的组合在制备用于食管鳞癌诊断的试剂盒中的应用。


2.一种用于食管鳞癌早期诊断的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由HMGB1、TLR4、TAK1、ATG5、SLC22A3和CD38组成。


3.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。


4.根据权利要求3所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体带有可检测的标记物。


5.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。


6....

【专利技术属性】
技术研发人员：王立东，吉佳佳，赵学科，宋昕，雷玲玲，韩雪娜，范宗民，王苒，李贝，王盼盼，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南;41