一种基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒及其制备使用方法技术

本发明专利技术提供了一种基于重组单链抗体的LP‑PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2。试剂R1包括NaH

Lp-PLA2 latex enhanced turbidimetric assay kit based on recombinant scFv and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒及其制备使用方法
本专利技术涉及临床检验领域，尤其涉及一种基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒及其制备使用方法。
技术介绍
LP-PLA2是一种能够促进炎症反应的生化指标，在血浆中以组成活性形式循环。LP-PLA2由炎症细胞分泌，包括单核细胞来源的巨噬细胞、T细胞和肥大细胞，主要与LDL-C结合。它是磷脂酶A2超家族的成员之一，具有水解磷脂底物sn-2酯键的能力。LP-PLA2的催化活性被认为是脂蛋白依赖性的，它的活性更多地集中在小而致密的LDL胆固醇上，包括被认为是最容易引起动脉粥样硬化的Lp(a)颗粒。除能水解血小板活化因子外，该酶对包括氧化磷脂和短链磷脂等多种极性磷脂具有特异性。因为这一作用机制，LP-PLA2在脂蛋白相关的氧化磷脂的代谢、修饰中起着重要作用，对血管炎症反应具有高的敏感性和特异性特点。LP-PLA2是一种由四百多个氨基酸残基组成的酶，人体血浆中的LP-PLA2主要是和富含Apo-B的脂蛋白相结合，低密度脂蛋白占4/5。当LP-PLA2和HDL结合时，LP-PLA2能够降解血小板活化因子，抑制血小板活化反应，从而抑制动脉粥样硬化的发展；但是，结合了LDL-C的LP-PLA2可水解和氧化LDL-C，最终使得内皮细胞功能受损、凋亡，致使更多促炎活性物质生成，促使粥样硬化斑块的生成和进展，是冠心病的预测生化指标。既往国外众多研究结果均提示：伴随着LP-PLA2浓度的升高，冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病人群也会逐渐增加。此外，LP-PLA2浓度升高与冠状动脉粥样硬化性心脏病病人心血管事件复发率相关。众多研究表明，LP-PLA2水平和冠状动脉粥样硬化性心脏病发生风险存在正相关性，并且不受其它危险因素干扰。抗体的基本单位是“Y”字型结构的Ig单体，含有两条H链和两条L链，IgH链和L链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variableregion,V)，重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariableregion，HVR)或互补决定区(complementaritydeterminingregion，CDR)，包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)氨基酸序列可变程度更高，VH和VL的3个CDR共同组成Ig的抗原结合部位(antigen-bindingsite)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。单链抗体(singlechainantibodyfragment，scFv)是由抗体VH和VL通过15-20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。目前，检测LP-PLA2的原理基于酶活性检测和抗原抗体反应，常用的方法是比色法、化学发光法、酶联免疫法。其中，比色法成本高，且反应干扰较大；化学发光检测成本高；酶联免疫法的特异性和灵敏度都较低，且检测周期较长，操作繁琐，不便于临床检测大规模使用。因此，目前急需一种成本低、特异性与灵敏度高，并且检测周期短、操作简单，适于临床检测大规模使用的LP-PLA2检测方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种成本低、特异性与灵敏度高，并且检测周期短、操作简单，适于临床检测大规模使用的基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒及其制备使用方法。本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：一种基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括的成分及相应含量为：NaH2PO41.00-5.00g/L，Na2HPO410.00-50.00g/L，NaCl3.00-20.00g/L，MgCl20.10-5.00g/L，PEG60005.00-29.00g/L，NaN30.1-5g/L，溶剂为纯化水；所述试剂R2包括的成分及相应含量为：NaH2PO41.00-5.00g/L，Na2HPO410.00-50.00g/L，NaCl3.00-20.00g/L，明胶0.1-1.0g/L，曲拉通-1000.01％-1.00％，BSA10.00-100.00g/L，NaN30.1-5g/L，重组抗人LP-PLA2单链抗体胶乳颗粒1.0-10.0％，溶剂为纯化水；其中，所述试剂R2中，重组抗人LP-PLA2单链抗体胶乳颗粒采用的是重组抗人LP-PLA2单链抗体与胶乳颗粒相偶联制成。作为本专利技术的优选方式之一，所述试剂R1包括的成分及相应含量具体为：NaH2PO42.86g/L，Na2HPO428.65g/L，NaCl6.87g/L，MgCl20.34g/L，PEG600016.00g/L，NaN31.00g/L，溶剂为纯化水。作为本专利技术的优选方式之一，所述试剂R2包括的成分及相应含量具体为：NaH2PO42.86g/L，Na2HPO428.65g/L，NaCl9.00g/L，明胶0.5g/L，曲拉通-1000.05％，BSA50.00g/L，NaN31.00g/L，重组抗人LP-PLA2单链抗体胶乳颗粒5.0％，溶剂为纯化水。作为本专利技术的优选方式之一，所述试剂R2中重组抗人LP-PLA2单链抗体胶乳颗粒的获取方法如下：(1)将1-5g直径大小为100-150nm的羧基化的乳胶微球加入到50mL的含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺100-300mg/L的pH6.0的0.1-0.5mol/L的MES缓冲液中，反应30min；(2)将反应液分成25mL/管，在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.1-0.5mol/L的磷酸盐缓冲液5mL混匀；继续在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.1-0.5mol/L的磷酸盐缓冲液25mL混匀；(3)每管加入重组抗人LP-PLA2单链抗体10-100mg，在37℃水浴反应6h；(4)向每管中加入含有1-30g/L的6-氨基己酸pH8.0的磷酸盐缓冲液10mL；(5)每管液体加小牛白蛋白0.1-4.0g，摇匀反应12h；(6)将所得的液体通过2次离心，转速为16000r/m，洗涤去掉未结合抗体，即得目标所需的重组抗人LP-PLA2单链抗体胶乳颗粒。作为本专利技术的优选方式之一，所述重组抗人LP-PLA2单链抗体的获取方法如下：(1)设计LP-PLA2CDS序列特异性引物：人LP-PLA2基因引物序列的上游引物序列如SEQIDNO.1所示，下游引物序列如SEQIDNO.2所示；LP-PLA2人工序列全序列如SEQIDNO.3所示；其中，上游引物带有NcoI酶切位点，下游引物带有EcoRV酶切位点，上下游引物均带有肠激酶酶切位点；(2)从人全血中提取基因组DNA，进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；(3)克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；/n所述试剂R1包括的成分及相应含量为：NaH

【技术特征摘要】
1.一种基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1包括的成分及相应含量为：NaH2PO41.00-5.00g/L，Na2HPO410.00-50.00g/L，NaCl3.00-20.00g/L，MgCl20.10-5.00g/L，PEG60005.00-29.00g/L，NaN30.1-5g/L，溶剂为纯化水；
所述试剂R2包括的成分及相应含量为：NaH2PO41.00-5.00g/L，Na2HPO410.00-50.00g/L，NaCl3.00-20.00g/L，明胶0.1-1.0g/L，曲拉通-1000.01％-1.00％，BSA10.00-100.00g/L，NaN30.1-5g/L，重组抗人LP-PLA2单链抗体胶乳颗粒1.0-10.0％，溶剂为纯化水；
其中，所述试剂R2中，重组抗人LP-PLA2单链抗体胶乳颗粒采用的是重组抗人LP-PLA2单链抗体与胶乳颗粒相偶联制成。


2.根据权利要求1所述的基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括的成分及相应含量具体为：NaH2PO42.86g/L，Na2HPO428.65g/L，NaCl6.87g/L，MgCl20.34g/L，PEG600016.00g/L，NaN31.00g/L，溶剂为纯化水。


3.根据权利要求1所述的基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2包括的成分及相应含量具体为：NaH2PO42.86g/L，Na2HPO428.65g/L，NaCl9.00g/L，明胶0.5g/L，曲拉通-1000.05％，BSA50.00g/L，NaN31.00g/L，重组抗人LP-PLA2单链抗体胶乳颗粒5.0％，溶剂为纯化水。


4.根据权利要求1所述的基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中重组抗人LP-PLA2单链抗体胶乳颗粒的获取方法如下：
(1)将1-5g直径大小为100-150nm的羧基化的乳胶微球加入到50mL的含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺100-300mg/L的pH6.0的0.1-0.5mol/L的MES缓冲液中，反应30min；
(2)将反应液分成25mL/管，在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.1-0.5mol/L的磷酸盐缓冲液5mL混匀；继续在转速为16000r/m的高速冷冻离心机中离心30min后，去掉上清液，每管加浓度为0.1-0.5mol/L的磷酸盐缓冲液25mL混匀；
(3)每管加入重组抗人LP-PLA2单链抗体10-100mg，在37℃水浴反应6h；
(4)向每管中加入含有1-30g/L的6-氨基己酸pH8.0的磷酸盐缓冲液10mL；
(5)每管液体加小牛白蛋白0.1-4.0g，摇匀反应12h；
(6)将所得的液体通过2次离心，转速为16000r/m，洗涤去掉未结合抗体，即得目标所需的重组抗人LP-PLA2单链抗体胶乳颗粒。


5.根据权利要求1或4所述的基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒，其特征在于，所述重组抗人LP-PLA2单链抗体的获取方法如下：
(1)设计LP-PLA2CDS序列特异性引物：人LP-PLA2基因引物序列的上游引物序列如SEQIDNO.1所示，下游引物序列如SEQIDNO.2所示；LP-PLA2人工序列全序列如SEQIDNO.3所示；其中，上游引物带有NcoI酶切位点，下游引物带有EcoRV酶切位点，上下游引物均带有肠激酶酶切位点；
(2)从人全血中提取基因组DNA，进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；
(3)克隆载体制备；
(4)表达载体制备；
(5)表达菌制备；
(6)重组人LP-PLA2的表达；
(7)将表达产物进行纯化和鉴定；
(8)BALB/c小鼠免疫达到指定抗体水平后取脾脏，制备杂交瘤细胞；
(9)筛选抗LP-PLA2阳性的细胞株，扩大培养，收获阳性细胞；
(10)提取阳性细胞的总RNA，使用小鼠Ig简并引物扩增出小鼠Ig轻重链可变区；
(11)测序获得该LP-PLA2单克隆抗体的基因序列，针对该VH和VL设计OverLapPCR引物和设计轻重链上下游引物：轻链上游引物的序列如SEQIDNO.4所示，轻链下游引物的序列如SEQIDNO.5所示；重链上游引物的序列如SEQIDNO.6所示，重链下游引物的序列如SEQIDNO.7所示；其中，轻链上游引物带有NcoI酶切位点，重链下游引物带有EcoRV酶切位点，轻链上游引物和重链下游引物均带有肠激酶酶切位点；并且，轻链下游引物和重链上游引物均含有柔性linker，柔性linker的序列如SEQIDNO.8所示；
(12)使用上述提取的阳性细胞的总RNA逆转录产物cDNA为模板扩增出VH-VL的融合基因片段；
(13)重组抗人LP-PLA2单链抗体的表达；
(14)重组抗人LP-PLA2单链抗体粗制品的制备；
(15)重组抗人LP-PLA2单链抗体粗制品纯化。


6.一种如权利要求1-5任一所述的基于重组单链抗体的LP-PLA2胶乳增强比浊法测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
一、抗人LP-PLA2重组单链抗体的制备
(1)设计LP-PLA2CDS序列特异性引物：人LP-PLA2基因引物序列的上游引物序列如SEQIDNO.1所示，下游引物序列如SEQIDNO.2所示；LP-PLA2人工序列全序列如SEQIDNO.3所示；其中，上游引物带有NcoI酶切位点，下游引物带有EcoRV酶切位点，上下游引物均带有肠激酶酶切位点；引物由华大基因进行合成；
(2)从人全血中提取基因组DNA,进行PCR扩增反应：采用大连宝生物公司DNA提取试剂盒TaKaRaMiniBESTWholeBloodGenomicDNAExtractionKit从人全血中提取DNA，使用大连宝生物公司TaKaRaLAPCRTMKitVer.2.1，利用合成的引物进行PCR反应；PCR反应条件“95℃预变性5min；95℃变性40s，58℃退火60s，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸10min”,获得PCR扩增产物；
(3)克隆载体制备：PCR产物经测序无误后使用连接酶连接到克隆载体pMD-18T中，导入到克隆菌感受态细胞DH5α中；
(4)表达载体制备：LB培养基37℃培养过夜，使用大连宝生物公司质粒提取试剂盒TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.4.0提取质粒，NcoI酶和EcoRV酶进行双酶切，将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将1293bp大小片段切下使用大连宝生物公司胶回收试剂盒TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0回收DNA，将回收的DNA使用连接酶连接到pET32a上，并导入BL21大肠埃希菌感受态细胞中；
(5)表达菌制备：LB培养基37℃220rpm摇菌2h，涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板培养过夜，取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，鉴定为阳性，即表示表达载体构建成功，记为pET-32a/rLP-PLA2；
(6)重组人LP-PLA2的表达：挑取pET-32a/rLP-PLA2工程菌于含氨苄青霉素50μg/mL的LB培养基中37℃摇菌1h来复苏工程菌活性，后在含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中放大培养8h；之后测OD值达到1.5时，加入IPT，28℃诱导表达5h；收集细菌，破碎后获得上清和沉淀，即为带HIS标签的目的蛋白rLP-PLA2；
(7)将表达产物进行纯化和鉴定：
离心收集细菌，加入质量体积比1:5的PBS重悬沉淀，-80℃与4℃反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率：400W，工作3s，间隔3s，超声破碎15min，重复3次，于4℃、12000r/min离心15min分别取上清、沉淀，得到粗制蛋白；
肠激酶酶切：将粗制蛋白使用大连宝生物公司肠激酶于23℃，酶切过夜；
亲和层析：将酶切后粗制蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱，用第一Elutionbuffer梯度洗脱，收集rLP-PLA2峰；所述第一Elutionbuffer的配方为：60mMTris-Cl、50mM还原性谷胱甘肽，pH7.0；
脱盐、缓冲液置换：将第一步纯化的rLP-PLA2过脱盐柱，用置换缓冲液置换，准备下一步离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：芮双印，符修乐，
申请(专利权)人：安徽大千生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34